[发明专利]一种丝素亲和肽的筛选方法

说明书

本发明公开了一种丝素亲和肽的筛选方法。制备丝素材料，利用丝素膜材料对各种噬菌体进行筛选，获得能够与丝素膜特异性结合的噬菌体，将步骤中与丝素材料特异性结合的噬菌体进行基因测序，获得相应的基因序列，进而可推到出其氨基酸序列。本发明所筛选的噬菌体对丝素材料具有很高的亲和性，为丝素材料的鉴定与分析提高更多的选择，应用前景广阔。

技术领域

本发明涉及了一种丝素亲和肽的筛选方法，属于生物技术领域。

背景技术

我国是丝绸文明及丝绸文化的发源地，现今也是世界上生产和出口丝绸最多的国家，在我国的世界贸易总额中占有重要的分量。丝绸的主要成分是丝素纤维蛋白，约占蚕茧总质量的70﹪—80﹪，由丙氨酸、甘氨酸、酪氨酸、丝氨酸等18种氨基酸通过多羧氨键连接形成。丝素纤维蛋白除在纺织工业中有其重要的应用外，在其它领域如食品、化工、生物医药等领域也有着重要的用途。由于丝素蛋白具有生物降解性、生物相容性、生物可降解性和可加工性等优良性能，可制备成多种形态的材料，如多孔状、膜状、纤维状和管状等，在科学研究中受到广泛的关注和研究。

随着对丝素材料功能化研究不断的深入，开发能够特异性结合丝素材料的试剂，用于对丝素材料的鉴别、结合、定量分析势在必行。申请号为01100056.2的专利，公开了一种用丝素蛋白修饰聚羟基酯材料的方法，用于丝素蛋白与其它材料的结合研究：具体方法是通过水溶性碳二亚胺(WSC)作为桥梁，将聚羟基酯材料与丝素蛋白进行固定，实现丝素蛋白对聚羟基酯材料的化学结合。然而，该方法主要是一种化学偶联的方法，操作过程中具有很强的毒性，存在化学试剂残留的缺点，还存在非特异性识别的问题(即，对所有蛋白都能交联)。时至今日，还没有一种环保、方便、快捷的方法能够专一识别并结合丝素材料的方法出现。

噬菌体展示是将遍码外源多肽的DNA序列通过基因工程技术插入到噬菌体基因的适当位置，使之稳定地在噬菌体外壳蛋白中表达外源多肽的技术。噬菌体是一种生物纳米纤维病毒，对人与动物无害，能特异性侵染含F因子的大肠杆菌。噬菌体展示技术最大的特点是直接将蛋白表型和对应基因型联系了起来，展示后的多肽能在相对独立的空间保持较好的生物活性。随着噬菌体展示技术的广泛应用，研究人员构建了大容量的噬菌体展示多肽库，在噬菌体外壳蛋白中展示约含1×10¹²种不同序列的多肽片段。通过对目标物的筛选，就能得到与目标物特异性结合的多肽。

发明内容

针对传统方法中存在的不足，本发明提出了一种丝素亲和肽的筛选方法，以丝素材料为目标物，利用商业化的M13-12噬菌体随机展示文库对其进行亲和筛选，筛选出与丝素材料高亲和性的多肽序列，具有安全、实用、方便和高效的优势。

因此可以用丝素材料对噬菌体展示文库进行亲和筛选，得到与丝素材料特异性结合的多肽，用于科学研究中丝素材料的鉴别、结合及分析，赋予丝素材料更多的功能。

本发明采用的技术方案是筛选过程中，通过洗涤去除非特异性结合丝素材料的噬菌体，通过洗脱将特异性结合丝素材料的噬菌体分离，然后对与丝素材料特异性结合的噬菌体基因测序，获得噬菌体外壳蛋白展示的多肽序列。

具体包括以下步骤：

1)制备丝素膜材料；

2)利用丝素膜材料对各种噬菌体进行筛选，获得能够与丝素膜特异性结合的噬菌体；

3)将步骤(2)中与丝素材料特异性结合的噬菌体进行基因测序，获得相应的基因序列，进而可推到出其氨基酸序列。

所述步骤1)中的丝素膜材料采用以下方式进行制备：先将蚕丝蛋白粉末溶于有机溶剂或者水中形成蚕丝蛋白溶液，将蚕丝蛋白溶液滴在聚乙烯板上风干，加酒精处理使蚕丝蛋白固化，得到不溶解于水的丝素膜。

所述步骤2)具体为：

a.封闭丝素材料：将家蚕丝素膜材料加入含有TBS和BSA的缓冲液，TBS和BSA各自的浓度可在0.1-10mg/ml的范围内变动；