[发明专利]一种同序双扩增的数字定量PCR方法

权利要求书

1.一种同序双扩增的数字定量PCR方法，其特征在于，为倍比稀释样本的双扩增定量PCR，包括以下步骤：先用3’末端缩短3-6b碱基的短靶引物于小体积PCR反应液预扩增10-15个循环，接着用末端不缩短的中部同序靶引物PCR液于同管内稀释预扩液10-20倍大体积荧光PCR 30-35个循环，矿物油密闭条件下无热盖扩增，总反应大于40个循环的同序双扩PCR确保≥“1”分子有效检出和无模板“0”无非特异性反应，根据样本稀释倍数、体积推算靶分子定量，所述方法为非疾病诊断，所述短靶引物为末端同序短靶引物。

2.根据权利要求1所述的同序双扩增的数字定量PCR方法，其特征在于，是倍比稀释样本进行两轮PCR双扩增，首轮将靶引物3’末端缩短的14-18base短引物2-5μL PCR液预扩增12-14个热循环来预放大1～2×10²-10⁴倍，再加入中部5-8b同序的17-24base长靶引物荧光PCR反应液稀释预扩反应液10-20倍进行20-100μL第二轮荧光PCR 30-32个热循环，矿物油密闭条件下无热盖扩增，确保单个靶分子及单个以上检出为“1”；本底“0”无非特异反应；根据样本稀释至零靶分子的倍数、体积计算样本靶含量的稀释定量检测数字PCR方法。

3.根据权利要求1所述的同序双扩增的数字定量PCR方法，其特征在于，是一组样本梯度稀释的简易数字定量PCR，样本于EP管进行倍比梯度稀释，取样本×10⁰～×10^-5开始10×(倍)稀释5次再2×(等比)稀释5个梯度，确保有靶分子管稀至无靶分子管的转折点落在梯度范围内，PCR管先加0.5-1μL的5×预扩短引物PCR反应液和2-5μL稀释样本及30-50μL矿物油密闭，进行短引物45℃-50℃退火的12-14个热循环第一轮PCR无热盖扩增；于第一轮同一管中加18μL-45/95μL的1×长引物PCR反应液，用加样吸头插入矿物油层下面加入，进行长靶引物54℃-60℃退火的30-35个热循环第二轮PCR无热盖扩增。

4.根据权利要求1所述的同序双扩增的数字定量PCR方法，其特征在于，是待测样本进行9个或以上梯次的10倍连续稀释后每个梯次的稀释梯度又等量分配到有限个反应孔/反应单元，进行共96孔板、384孔板两轮双扩增PCR统计定量，采用样本预先10倍稀释的9组梯度重复PCR，总有一组10个PCR其靶分子理论数位于0-1之间，能取得相当于万级甚至百万级反应单元微流控或微滴化装置的功效，以及在此基础之上加一两级的100倍稀释或取舍；如在第二轮1×PCR反应液中加入1×SYBR Green I荧光染料可在第二轮进行荧光PCR检测，或于第二轮PCR反应后每孔加入2-5μL的EB(0.5μg/mL)于矿物油层下面，置96孔板于紫外灯下显色计数或于荧光光度仪检测。

5.根据权利要求1所述的同序双扩增的数字定量PCR方法，其特征在于，待测样本进行9个梯次的10倍连续稀释后每个梯次的稀释梯度以缩小10倍体积等量分配至100-10000个反应单元聚二甲基硅氧烷微孔芯片，使用原位PCR仪进行两轮巢式PCR数字定量。

6.用于权利要求1-5中任一项所述的同序双扩增的数字定量PCR方法的基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒成份包括：核酸提取试剂，dNTPs及dUTP，UDG酶，Taq，HKTaq酶及其缓冲液，预扩短引物F/R，长靶引物F/R，染料EB及SYBR Green I，纯化水dH₂O，矿物油。