[发明专利]一种同序双扩增的数字定量PCR方法

说明书

本发明公开了一种同序双扩增的数字定量PCR方法，该方法是一种倍比稀释样本定量PCR方法，其特征是先用3’端缩短3‑6b碱基的短靶引物预先扩增10‑15个循环而预放大10²‑10⁴倍，然后用中部同序的长靶引物PCR反应液于同管内稀释预扩液10‑20倍再荧光PCR 30‑35循环，矿物油密闭下无热盖扩增，预扩短引物末端5‑8b同序且与中部同序的长靶引物同源而不易引物间聚合，稀释后35循环内无非特异性，以确保≥“1”分子有效检测和“0”无扩增反应的数字dPCR方法。

技术领域

本发明属于分子生物学及分子检验的核酸扩增PCR技术领域，具体涉及通过末端稍短同引物预扩增来提高灵敏度和部分同序引物限制其非特异性而进行稀释定量的数字PCR领域。

背景技术

定量检验方法包括标准曲线定量法、内标定量方法和稀释定量概念法。所谓稀释定量是通过样本倍比稀释靶分子直至无靶分子反应再测稀释倍数的定量数字化方法，或数字定量检测或数字化诊断是指确保阳性单个分子或单个以上分子均有检测信号而定为1、阴性绝对无反应信号而定为0的条件下，样本稀释、分散至大量的微型分隔单元使理论上每检测单元含0-1个靶分子，通过检测单元反应信号0-1计数和有限稀释倍数而对靶分子进行定量的方法，以便于计算机0或1模式的自动化操作，但前提必须是检测方法本身对1个分子或0分子可靠区分。然而传统的化学反应、酶免疫反应等均是检测信号强度与待测分子含量成线性比例且信号简单相加的低灵敏度检测方法，例如典型的靶分子A与加入试剂分子B形成产物C反应公式，有多少靶分子A就可以从耗去多少试剂B或产生多少分子C的信号相加来计量，但其灵敏度即最小检出量往往大于纳克水平(ng/ml)，如1纳克水分子约为3×10¹³个分子数，可见低于检测方法灵敏度范围的靶分子测不出而容易假阴性反应，传统低灵敏度方法远远区分不了1个靶分子和0分子的差别，所以无法适用于有限稀释法的数字化定量检测方法。

上世纪80年代诞生的核酸指数扩增的PCR技术，以其2ⁿ(n为扩增循环数)放大倍数能检测低至数十乃至数个拷贝的靶分子，然而30个循环扩增的灵敏度仍不足以测出1个靶分子和0分子的区别，超过30个循环扩增又带来严重的非特异性及假阳性；且这种第一代的终末/终点PCR因同样量样本经扩增超级放大后变化太大而终产量不均一，致使难以监测产物量来定量检测。随后两轮扩增的巢式PCR应用(Porter-Jordan K.，et al.，1990，J.MedVirol30(2)：85-91)以超过总数40个循环扩增的极高灵敏度为单个靶分子检测提供了可能，预扩外引物二聚体产物虽不会成为二轮扩增模板，但不同序的外侧引物大大增加了系统引物间聚合非特异性，需要预扩后凝胶电泳纯化来消除外引物非特异性；1992年，Sykes等人(Sykes P.J.，et al.，1992，BioTechniques 13：444-449)初步尝试了基于样本有限稀释和泊松分布计数的定量巢式PCR，并首次提出了数字化定量理念，由于这类PCR系统内引物二聚体扩增和体系外气雾胶交叉污染的严重非特异性而抵消了二次扩增放大作用。随后，Higuchi另辟溪径，同时扩增和“闭管”荧光检测的实时荧光PCR方法，减少了PCR后处理的交叉污染，而通过扩增曲线指数期测定来对应初始模板数的相对定量，即进入指数期的扩增循环数与初始模板数呈反对数关系，但一般采用荧光染料的实时荧光PCR仍然于30个扩增循环处产生引物二聚体非特异性扩增，从而干扰低浓度的靶分子定量。1997年，不与非特异性扩增杂交的系列探针法实时荧光PCR(Wittwer C.，et al.，1997，BioTechniques22：130-138)显著减少了非特异性反应，尤其以水解探针Taqman方法逐步成熟并广泛应用于临床检验，已被公认为第二代q-PCR定量PCR技术。但定量需要参考品标准曲线或内标校正，和有限的灵敏度仍不足以测出1个靶分子和0分子的区别而仍存在一定的数字定量应用限制。