[发明专利]一种表达藻蓝胆素的基因工程菌株及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术和生物工程技术领域，具体涉及一种表达藻蓝胆素的基因工程菌株及其构建方法和应用。

背景技术

藻胆蛋白主要存在于红藻、蓝藻、隐藻及少数甲藻中，由脱辅基蛋白和色基组成，是色素蛋白复合体，能捕获高等植物不能利用的蓝绿光。同时藻胆蛋白具有多种功效，可作为荧光探针，食品添加剂，保健品和药品等。根据藻胆蛋白吸收光谱性质的差异，可将其分为四大类即藻红蛋白、藻红蓝蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白。具有光学活性的藻胆蛋白主要是由脱辅基藻胆蛋白和藻胆素共价结合而成。藻胆蛋白具有荧光活性，是因为含有色素—藻胆色素，因此藻胆色素的合成是形成有光学活性藻胆蛋白非常重要的代谢途径。

藻胆色素的合成是以氨基乙酰丙酸作为前体物质开始的。氨基乙酰丙酸在胆色素原合酶(Porphobilinogen synthase)的作用下合成胆色素原，再利用胆色素原脱氨酶(Hydroxymethyl-bilanesynthase)、尿卟啉原III合酶(Uroporphyrinogen III synthase,UPS)、尿卟啉原III脱羧酶(Uroporphyrinogen III decarboxylase,UDC)、粪卟啉原III氧化酶(Coproporphyrinogen III oxidase,aerobic,COXae)、原卟啉原IX氧化酶(Protoporphyrinogen IX oxidase,aerobic,POXae)数步反应生成原卟啉IX。原卟啉IX在铁离子螯合酶等酶的作用下生成血红素。血红素氧化酶(heme oxygenase)将血红素氧化，氧化发生在IXa位点使共轭环断裂，生成胆绿素IXa，胆绿素IXa在不同的还原酶作用下产生不同类型的藻胆色素。

目前，对于具荧光活性的藻蓝蛋白的异源表达的研究多集中于集胞藻(Synechocystis sp.PCC6803)，鱼腥藻(Anabaena sp.strain PCC7120)中。而重要经济蓝藻-钝顶节旋藻的相关基因还没有被克隆，其在合成有荧光活性藻蓝蛋白中的作用还缺乏研究。节旋藻(Arthrospira)营养丰富，富含维生素，微量元素，人体必需的8种氨基酸，蛋白含量高达60-70％。是目前公认的唯一一种人体可安全食用并具有药用价值的经济藻类。其中含有的藻蓝蛋白可作为一种天然色素应用于食品、化妆品等领域。

发明内容

本发明提供了一种表达藻蓝胆素的基因工程菌株及其构建方法和应用。通过本发明的技术方案，获得的重组表达菌株H(314)P(314)BAEF具有较高的重组藻蓝蛋白表达量。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种表达藻蓝胆素的基因工程菌株H(314)P(314)，其分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.12909。

进一步的：所述菌株H(314)P(314)含有如序列表SEQ ID No：1序列所示的hoxⅠ基因。

进一步的：所述hoxⅠ基因来源于节旋藻Arthrospira platensis FACHB314。

进一步的：所述菌株H(314)P(314)含有如序列表SEQ ID No：3序列所示的pcyA基因。

进一步的：所述pcyA基因来源于节旋藻Arthrospira platensis FACHB314。

进一步的：所述菌株H(314)P(314)经IPTG诱导表达呈现蓝绿色，在580-590nm激发波长下，在635-645nm处发射荧光。

本发明还提供了所述的表达藻蓝胆素的基因工程菌株H(314)P(314)的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：

(1)克隆节旋藻Arthrospira platensis FACHB314的hoxⅠ基因和pcyA基因，并将其连入克隆载体pMD19-T中，分别获得质粒pMD19T-hoxⅠ(314)和pMD19T-pcyA(314)；

(2)将所述质粒pMD19T-hoxⅠ(314)用BamHI和SacI进行双酶切，所述质粒pMD19T-pcyA(314)用SacⅠ和SalⅠ进行双酶切，回收目的片段hoxⅠ(314)基因和pcyA(314)基因，并将二者连接入pET24a(+)表达载体中，构建出重组表达质粒pET24a-hoxⅠ(314)-pcyA(314)；