[发明专利]一种快速创制转基因玉米双单倍体纯合后代的方法

权利要求书

1.一种快速创制转基因玉米双单倍体纯合后代的方法，其特征在于：包括

试验材料：玉米单倍体诱导系东诱1号、L7和JY3，为东北农业大学农学院玉米课题组选育，具有R-nj标记；用于创建单倍体的F1杂交种，其母本为转玉米精氨酸酶ZmARG基因玉米HiII的T2代株系，父本为合344；上述常规玉米材料公众可从东北农业大学农学院玉米课题组获得；

试验方法：

材料的种植：采用随机区组设计，3次重复，双行区，行长5m，株距30cm，行宽70cm，每行17株；两地田间管理标准一致，同普通玉米生产田；5米行长，株距30cm，行距70cm；杂交种一次播种，时间为当年4月29日，诱导系分3期播种，时间分别为当年4月29日，5月7日和5月11日；

授粉：用诱导系给F1杂交种授粉，挂牌记录授粉时间，每个诱导系至少授10株；

组织培养的试验流程：

培养基：

(1)筛选培养基：MS液体培养基+100uM ABA；

(2)加倍培养基：MS液体培养基+2mg/L天冬酰胺+1mg/L BAP+0.05％的秋水仙素；

(3)生长培养基：MS固体培养基；

操作方法：

(A)幼穗的消毒

分别在授粉后18d，20d取幼穗，剥去苞叶，在75％乙醇中灭菌8min，0.1％HgCl₂消毒6min，无菌水冲洗3次；

(B)幼胚的剥取：

取幼胚，盾片朝下置于培养皿中用筛选培养基浸润的无菌滤纸上，28℃，16h光照/8小时黑暗，培养24h；

(C)单倍体幼胚的加倍：

挑选出盾片无色素沉着的单倍体幼胚，盾片朝上接种到培养皿中用加倍培养基浸润的无菌滤纸上，26℃黑暗培养24h；

(D)幼胚培养：

将幼胚转移至生长培养瓶中，盾片向下，26℃暗培养1周，之后26℃光培养2-3周直至根发育完全；每瓶接种15个左右；

(E)移栽：

将小苗移栽至土壤基质中，温室内培养，根据叶鞘颜色鉴别单倍体植株，直至成熟，严格自交，收获种子；

(F)双单倍体的PCR检测：

采用CTAB小量法提取玉米幼苗叶片的总DNA；由于ZmARG基因为玉米内源基因，根据启动子Ubi序列和目的基因序列设计引物，引物ARG-F位于启动子Ubi序列内部，引物ARG-R位于目的基因序列内部，产物大小为775bp；筛选标记基因为抗除草剂草甘膦基因，产物大小为522bp；引物序列如下：

ARG-F:5’-CGCCCTTCTTTGGTGAT-3’

ARG-R:5’-CCCTGCCTTCATACGCT-3’

PCR反应程序为，94℃5min，94℃30s，60℃30s，72℃1min，72℃8min，32个循环；1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物；

数据统计方法:

单倍体的诱导率＝单倍体幼胚数/接种幼胚数*100％；加倍率＝结实株数/再生苗数*100％；采用Excel 2010对试验数据进行初步整理，使用统计分析软件SPSS Statistics 17.0中独立样本T检验和方差分析程序进一步分析。

2.根据权利要求1所述的快速创制转基因玉米双单倍体纯合后代的方法，其特征在于：所述步骤(E)中的叶鞘颜色鉴别单倍体植株的叶鞘颜色为绿色叶鞘。

3.根据权利要求1所述的快速创制转基因玉米双单倍体纯合后代的方法，其特征在于：所述步骤(E)中自交时，如果散粉困难，需要用针挑破花药释放花粉。