[发明专利]一种快速创制转基因玉米双单倍体纯合后代的方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，尤其涉及一种快速创制转基因玉米双单倍体纯合后代的方法。

背景技术

玉米(Zea mays)是重要的粮食和饲料作物，在我国玉米种植面积已升至为第一位、单产和总产保持第二位，仅次于水稻(李少昆，2010)。同时由于玉米也是进行遗传研究的良好材料随着世界经济的发展，物质生活水平的提高，人们对玉米的需求趋势呈刚性增长。利用杂种优势、选育优良玉米杂交种的基础和关键选育优良玉米自交系。传统选育优良自交系是根据育种目标选用优异种质资源组配基础材料后连续自交5～6代以上，性状稳定后进行配合力测定,再根据杂种优势模式组配杂交组合。玉米单倍体是指具有配子体染色体数目的植物体,采用玉米单倍体育种技术可在一定程度上克服传统育种方法存在的不足。利用单倍体研究进行育种可以缩短产生纯合品系的时间。

目前普遍使用的玉米单倍体诱导系Stock6是Ed Coe(1950)发现的,该系自交后代中可产生约2.52％的单倍体植株。后又经过两次回交和两次自交导入了控制子粒性状和植株性状(紫色叶片、茎秆、雄穗和花药)的显性标记基因，90％个体的显性色素基因已达纯合,基因型为ABPICR-njy,它具有两个标记性状：子粒有斑纹、成株叶片和叶鞘呈紫色，均是由互补基因控制。表现型是果穗子粒为白色硬粒型，子粒顶端有紫色斑块和紫色胚芽，植株具有深紫色的叶片、茎秆、雄穗和花药,具有三重性状标记。Stock6诱导产生单倍体的原理已经清楚，双授精过程中一个精子与极核结合，而另一个精子不能与卵结合形成授精卵。在育种实践中用作父本被诱导的育种试材作母本，大约有3％的单倍体胚。Stock6具有杂交诱导母本雌配子体形成高频率单倍体的能力,符合单倍体育种的基本要求,从而使玉米单倍体育种变为一种现实的育种方法。但是在实际应用中发现Stock6存在许多缺陷,如花粉量很少或者不散粉、自交结实性很差、穗粒腐病严重、子粒Navajo遗传标记表达较弱。

国外通过杂交改良的方法已经从Stock6中衍生出了一些新的诱导系,如法国的SW14、俄罗斯的Krasnodar Markers和摩尔多瓦的ZMS等。这些新的诱导系不但适应当地的生态环境,而且诱导率有了进一步的提高。因此利用价值已经大大超出Stock6。

我国利用单倍体诱导系选育自交系的研究开展较晚,单倍体育种体系都是以改良Stock6为主,选育的单倍体诱导系较少。中国农业大学刘志增(1998)用高油玉米群体BHO和Stock6杂交,经多代自交和测交选育出农大高诱1号单倍体诱导系,其诱导率可高达5.8％。2007年吉林省农业科学院的才卓等从Stodk6与M278的杂交后代中连续6代测交和选择,育成了高频率单倍体诱导系吉高诱系3号,对20个没基因型材料的单倍体诱导结果表明,其单倍体诱导率介于5.50％～15.94％,平均为10.40％。

在使用单倍体诱导系选系程序中,单倍体个体必须加倍成为二倍体才能产生可育后代。单倍体的加倍频率直接关系到单倍体育种的效率。人们对诱导单倍体进行了大量研究,并取得了一定成绩。据Chase报道,单倍体的自然加倍频率为10％左右；Zabirova等和Shatskaya的资料显示,许多材料的单倍体自然加倍率低于5％，有些材料不发生自然加倍。诱导产生的单倍体植株自然加倍率很低,需经过人工加倍才能得到更多的DH系,以满足育种需要。早在1952年Chase曾提出用秋水仙素溶液注射幼苗的盾片节进行加倍,Gayen在1994年使用浸种法,使加倍率达到了18％。尽管如此,到目前为止玉米单倍体的化学加倍率仍比较低。为此需要探索更为有效的加倍方法，提高加倍率，以期为玉米单倍体人工加倍提供一种有效方法。

玉米的遗传转化效率较低，一般低于5％，且具有较强基因型依赖性，再生频率较高、宜于诱导II型胚性愈伤组织的是玉米杂交种HiII。公认的玉米遗传转化方法为农杆菌侵染HiII的幼胚，经过诱导愈伤组织、分化出再生植株。之后将转基因的HiII后代与普通玉米自交系杂交后回交6-8代，自交2-3代，将目标基因转入普通玉米自交系中，试验周期长，耗时费力。利用单倍体诱导技术，对转基因的HiII后代与普通玉米自交系杂交的F1代进行单倍体诱导进而加倍成纯合二倍体，可大大加速基因型纯合的速度。

发明内容

本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种快速创制转基因玉米双单倍体纯合后代的方法。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

本发明包括：