[发明专利]一种重组人热休克蛋白10及其编码基因与制备方法

权利要求书

1.一种重组人热休克蛋白10，其特征在于，包括：

(1)人热休克蛋白10的氨基酸序列；

(2)细胞穿膜肽的氨基酸序列；和

(3)柔性连接肽的氨基酸序列，用于连接所述人热休克蛋白10的氨基酸序列和所述细胞穿膜肽的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的重组人热休克蛋白10，其特征在于，所述细胞穿膜肽的氨基酸序列是序列表中SEQ ID No:4的序列，或者，与序列表中SEQ ID No:4的序列的同源性在90％以上(优选95％，更优选98％)且具有相同活性的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的重组人热休克蛋白10，其特征在于，所述柔性连接肽的氨基酸序列是序列表中SEQ ID No:6的序列。

4.根据权利要求1-3任一项所述的重组人热休克蛋白10，其特征在于，所述重组人热休克蛋白10的氨基酸序列是序列表中SEQ ID No:1的氨基酸序列。

5.权利要求1-4任一项所述的重组人热休克蛋白10的制备方法，其特征在于，包括：

(1)获得基因：人工全基因合成序列表中的SEQ ID No:2的序列，对pPIC9K载体及人工全基因合成的SEQ ID No:2的序列进行XhoⅠ和NotⅠ双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌，提取质粒；

(2)转化：将步骤(1)制备的质粒与感受态毕赤酵母混合进行转化，获得转化后菌落；

(3)筛选多拷贝重组子：将步骤(2)转化后的菌落进行进一步培养，筛选转化子，获得重组人热休克蛋白10工程菌；

(4)发酵培养诱导表达：对步骤(3)获得的重组人热休克蛋白10工程菌进行发酵培养获得重组人热休克蛋白10发酵液；

(5)纯化：对步骤(4)获得的重组人热休克蛋白10发酵液依次进行固液分离、过滤、浓缩和离子交换层析得到产品。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)的纯化的具体步骤为：将步骤(4)得到的发酵液经离心进行固液分离，取上清液，对发酵上清液进行微滤，收集滤液，再进行超滤脱盐浓缩，收集浓缩液，然后进行离子交换层析，即可得到产品。

7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，包括：

(1)制备质粒

人工全基因合成序列表中的SEQ ID No:2的序列，然后对pPIC9K载体及人工全基因合成的SEQ ID No:4的序列进行XhoⅠ和NotⅠ双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌，提取质粒，命名为pPIC9K-YARA-HSP10；

(2)毕赤酵母电转化

将经SalⅠ内切酶线性化的pPIC9K-YARA-HSP10质粒，与毕赤酵母感受态细胞混匀，转至冰预冷的电转化杯中，电击，加入冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，涂布MD培养基平板，倒置培养，在MD培养基平板上长出菌落；

(3)多拷贝插入重组子的筛选

将MD培养基平板上长出的菌落对应接种到G418浓度分别为0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L的YPD平板上，培养，筛选获得转化子；

(4)发酵

将筛选到的工程菌接种于BMGY培养基中，振荡培养，作为一级种子转接于装有FBS培养基的发酵罐中，pH值在5.5左右，作为二级种子转接入装有FBS培养基的大罐发酵；

(5)纯化

将步骤(4)得到的发酵液经离心进行固液分离，取上清液，用分子截留量为80000D的中空纤维超滤系统进行超滤，收集滤液，用分子量为1000D的卷式超滤膜超滤，收集浓缩液，随后进行离子交换层析，即可得到产品。

8.权利要求1-4任一项所述重组人热休克蛋白10的编码基因。

9.根据权利要求8所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因是序列表中SEQ ID No:2的核苷酸序列，或者，与SEQ ID No:2具有至少90％(优选95％，更优选98％)同源性且编码相同功能蛋白的核苷酸序列。

10.含有权利要求8或9所述编码基因的表达载体。

11.含有权利要求8或9所述编码基因的细胞系。