[发明专利]一种重组人热休克蛋白10及其编码基因与制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种重组人热休克蛋白及其编码基因，本发明还涉及所述重组人热休克蛋白的制备方法。

背景技术

热休克蛋白(Heat Shock Proteins，HSPs)是在从细菌到哺乳动物中广泛存在的一类热应激蛋白质，当有机体暴露于高温时就会由热激发合成此类蛋白质，来保护有机体自身。热休克蛋白10(HSP10)是热休克蛋白家族中的一员，又称为CPN10、GROES或HSPE1，其广泛存在于人、动物、微生物和植物细胞中，是一类在遗传上高度保守的蛋白质。人热休克蛋白10基因位于2号染色体q33.1位点，该基因长度是306bp，编码产物人热休克蛋白10由102个氨基酸残基组成，相对分子质量约为10KD。

人热休克蛋白10广泛存在于人体的各类组织中，研究表明，HSP10在多种应激条件下，比如，高温、紫外线、药物、重金属、缺氧等的刺激下大量表达，作为分子伴侣保护细胞功能，抑制细胞凋亡的发生；能够通过翻译后修饰扩大胰岛素样生长因子1受体通路，保护心肌细胞免受缺血性损伤；能够减轻同种移植的免疫排斥反应；同时，也有研究提示，HSP10与生殖不孕不育有关。大量的研究表明，HSP10具有不可限量的市场价值，不仅可以用于药物开发，还可以作为生物美容的新成员，应用于美容化妆品行业中。

虽然人热休克蛋白10具有广阔的应用领域，但是当前还缺少高效表达人热休克蛋白10的方法，并且，当人热休克蛋白10应用于化妆品中时，存在皮肤穿透能力较差的问题。

发明内容

本发明的发明目的是针对现有技术的缺陷，提供一种重组人热休克蛋白、其编码基因以及制备方法。

一方面，本发明提供了一种重组人热休克蛋白10，包括：

(1)人热休克蛋白10的氨基酸序列；

(2)细胞穿膜肽的氨基酸序列；和

(3)柔性连接肽的氨基酸序列，用于连接所述人热休克蛋白10的氨基酸序列和所述细胞穿膜肽的氨基酸序列。

前述的重组人热休克蛋白10，所述细胞穿膜肽的氨基酸序列是序列表中SEQ ID No:4的序列，或者，与序列表中SEQ ID No:4的序列的同源性在90％以上(优选95％，更优选98％)且具有相同活性的氨基酸序列。

前述的重组人热休克蛋白10，所述柔性连接肽的氨基酸序列是序列表中SEQ ID No:6的序列。

前述的重组人热休克蛋白10，所述重组人热休克蛋白10的氨基酸序列是序列表中SEQ ID No:1的氨基酸序列。

另一方面，本发明提供了重组人热休克蛋白10的制备方法，包括：

(1)获得基因：人工全基因合成序列表中的SEQ ID No:2的序列，对pPIC9K载体及人工全基因合成的SEQ ID No:2的序列进行XhoⅠ和NotⅠ双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌，提取质粒；

(2)转化：将步骤(1)制备的质粒与感受态毕赤酵母混合进行转化，获得转化后菌落；

(3)筛选多拷贝重组子：将步骤(2)转化后的菌落进行进一步培养，筛选转化子，获得重组人热休克蛋白10工程菌；

(4)发酵培养诱导表达：对步骤(3)获得的重组人热休克蛋白10工程菌进行发酵培养获得重组人热休克蛋白10发酵液；

(5)纯化：对步骤(4)获得的重组人热休克蛋白10发酵液依次进行固液分离、过滤、浓缩和离子交换层析得到产品。

前述的制备方法，所述步骤(5)的纯化的具体步骤为：将步骤(4)得到的发酵液经离心进行固液分离，取上清液，对发酵上清液进行微滤，收集滤液，再进行超滤脱盐浓缩，收集浓缩液，然后进行离子交换层析，即可得到产品。

前述的制备方法，包括：

(1)制备质粒

人工全基因合成序列表中的SEQ ID No:2的序列，然后对pPIC9K载体及人工全基因合成的SEQ ID No:4的序列进行XhoⅠ和NotⅠ双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌，提取质粒，命名为pPIC9K-YARA-HSP10；

(2)毕赤酵母电转化

将经SalⅠ内切酶线性化的pPIC9K-YARA-HSP10质粒，与毕赤酵母感受态细胞混匀，转至冰预冷的电转化杯中，电击，加入冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，涂布MD培养基平板，倒置培养，在MD培养基平板上长出菌落；

(3)多拷贝插入重组子的筛选