[发明专利]一种用于双末端测序的反应体系、其组成的试剂盒和应用

权利要求书

1.一种用于双末端测序的反应体系，其特征在于，所述反应体系包括1×Phi29buffer、dNTP、Phi29聚合酶和PCR增强剂；

所述PCR增强剂为甘油、DMSO、Triton X-100和海藻糖的组合，或甘油、DMSO、Triton X-100和甜菜碱的组合；

所述甘油按体积分数计占所述反应体系的30％；

所述DMSO按体积分数计占所述反应体系的7％；

所述Triton X-100按体积分数计占所述反应体系的0.8％；

所述甜菜碱的摩尔浓度为0.1-0.6M；

所述海藻糖的摩尔浓度为0.02-0.2M；

所述反应体系还包括CTAB；

所述CTAB的摩尔浓度为1-5mM。

2.根据权利要求1所述的用于双末端测序的反应体系，其特征在于，

所述甜菜碱的摩尔浓度为0.2-0.6M；

所述海藻糖的摩尔浓度为0.08-0.2M。

3.根据权利要求2所述的用于双末端测序的反应体系，其特征在于，

所述甜菜碱的摩尔浓度为0.5M；

所述海藻糖的摩尔浓度为0.1M；

所述CTAB的摩尔浓度为1mM。

4.一种用于双末端测序的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-3中任一项所述的反应体系。

5.一种在双末端测序中生成互补链的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将DNA纳米球装载到芯片上，使用包含测序引物的试剂进行DNA纳米球5’端测序；

(2)5’端测序完成后，使用切除试剂切除最后一个碱基所带的荧光和阻断基团，使用洗脱试剂进行洗涤；

(3)加入如权利要求1-3中任一项所述的反应体系，生成互补链。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的测序引物的核苷酸序列如SEQID NO.1所示；

步骤(3)所述生成互补链具体包括以下步骤：

将所述反应体系混合均匀后加入芯片表面，在35-37℃下进行互补链生成，生成时间为30-40min；

所述反应体系包括：1×Phi29 buffer、摩尔浓度500mM dNTP、10U Phi29聚合酶、体积分数30％的甘油、体积分数7％的DMSO、体积分数0.8％的Triton X-100和摩尔浓度0.1-0.6M的甜菜碱，或1×Phi29 buffer、摩尔浓度500mM dNTP、10U Phi29聚合酶、体积分数30％的甘油、体积分数7％的DMSO、体积分数0.8％的Triton X-100和摩尔浓度0.02-0.2M的海藻糖。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，

所述甜菜碱的摩尔浓度为0.2-0.6M；

所述海藻糖的摩尔浓度为0.04-0.15M。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，

所述甜菜碱的摩尔浓度为0.5M；

所述海藻糖的摩尔浓度为0.1M。

9.一种双末端测序的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)实施如权利要求5-8中任一项所述的方法，生成互补链；

(2)加入阻断试剂进行末端阻断；

(3)再加入包含互补链测序引物的试剂，进行测序。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述包含互补链测序引物的试剂为包含互补链测序引物与CTAB的混合物；

所述互补链测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述互补链测序引物的摩尔浓度为3-6μM；

所述CTAB的摩尔浓度为1-5mM。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，

所述互补链测序引物的摩尔浓度为4μM；

所述CTAB的摩尔浓度为1mM。

12.如权利要求1-3中任一项所述的反应体系、如权利要求4所述的试剂盒、如权利要求5-8中任一项所述的在双末端测序中生成互补链的方法或如权利要求9-11中任一项所述的双末端测序的方法在高通量测序中的应用。