[发明专利]一种用于双末端测序的反应体系、其组成的试剂盒和应用

说明书

本发明提供了一种用于双末端测序的反应体系、其组成的试剂盒和应用，具体涉及一种提高双末端测序质量的反应体系、其组成的试剂盒和提高双末端测序质量的方法，所述反应体系包括1×Phi29 buffer、dNTP、Phi29聚合酶和PCR增强剂。本发明在生成互补链的反应体系中添加组合的PCR增强剂，通过甘油、DMSO、Triton X‑100、海藻糖和甜菜碱之间相互促进，发挥了协同增效的作用，能明显提高互补链合成的效率，提高测序的准确度，测序的平均信号值提高了1.1倍；同时采用CTAB处理生成的互补链，限制了Phi29酶的外切活性，显著降低了LagRunon值。

技术领域

本发明涉及DNA测序技术领域，涉及一种用于双末端测序的反应体系、其组成的试剂盒和应用，具体地，涉及一种提高双末端测序质量的反应体系、其组成的试剂盒和提高双末端测序质量的方法。

背景技术

多重置换扩增(MDA)是目前公认的最好的单细胞基因组扩增技术，它能对全基因组进行高保真的均匀扩增，扩增出10～100kb大小的片段，能提供大量均一完整的全基因组序列。MDA技术广泛用于全基因组扩增，是目前对整个基因组覆盖最广，各位点扩增偏倚最小的全基因组扩增方法。目前，此方法也被用于高通量测序领域。

DNA纳米球(DNAnanoball,DNB)技术是将基因组DNA首先经过片段化处理，再加上接头序列，并环化形成单链环状DNA，随后使用滚环扩增技术(Rolling circleamplification,RCA)将单链环状DNA扩增2-3个数量级，所产生的扩增产物称为DNB，最终纳米球经过DNB装载技术固定在阵列化的硅芯片上。

Rongqin Ke,et.al.,Patent.,US 20160237488 A1公开了基于MDA原理进行DNB互补链生成来实现对DNB双末端的测序的方法，DNB在进行双末端测序中，测完一条链后，首先需要长出一条互补链，再对其互补链进行测序，因此互补链长得好坏对测序质量的影响很大。现有的方法是使用常规的MDA方法进行互补链生成，然后进行测序，这种方法会导致测序信号较低，测序质量较差。

目前的DNB互补链生成方法有两方面不足：(1)互补链测序信号较低；(2)互补链测序指标LagRunon(Lag指测序时碱基合成滞后，Runon指测序时碱基合成超前)明显较高，影响测序质量，如何提供互补链的测序信号，如何降低测序指标LagRunon成为一个亟待解决的问题。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种用于双末端测序的反应体系、其组成的试剂盒和应用，具体涉及一种提高双末端测序质量的反应体系、其组成的试剂盒和提高双末端测序质量的方法，本发明采用不同组合的PCR增强剂及CTAB处理生成的互补链，提高了测序的质量。

为达此目的，本发明采用了以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种用于双末端测序的反应体系，所述反应体系包括1×Phi29 buffer、dNTP、Phi29聚合酶和PCR增强剂。

本发明中，所述dNTP和Phi29聚合酶为现有技术中MDA技术中的常规组分，所述dNTP和Phi29聚合酶可采用现有技术中的常规浓度都是可行的，在本发明中，所述dNTP的摩尔浓度为500mM，所述Phi29聚合酶的浓度为10U。

根据发明，所述PCR增强剂为甘油、DMSO、Triton X-100、海藻糖或甜菜碱中的任意一种或至少两种的组合，优选为甘油、DMSO、Triton X-100和海藻糖的组合，或甘油、DMSO、Triton X-100和甜菜碱的组合，或甘油、DMSO、Triton X-100、海藻糖和甜菜碱的组合，进一步优选为甘油、DMSO、Triton X-100和海藻糖的组合，或甘油、DMSO、Triton X-100和甜菜碱的组合。