[发明专利]用于分析重复序列的mPCR方法

说明书

本申请是申请日为2011年10月28日，申请号为201180063284.3，发明名称为“用于分析重复序列的mPCR方法”的中国专利申请的分案申请。

本申请要求2010年10月29日提交的美国临时申请No.61/408,367的权益，其通过提述完整并入本文。

本申请中所描述的工作在来自Eunice Kennedy Shriver国立儿童健康和人类发展研究所(National Institute of Child Health&Human Development)的拨款号R43HD060450和R44HD060450下部分得到联邦政府资助。因而，联邦政府可以具有本发明的某些权利。

本发明属于核酸分析领域，特别地，涉及用于测定富含GC的模板和产物的甲基化状态的方法。另外，本发明涉及可以依照本文中所描述的方法使用的GC参照标准品。

在某些实施方案中，使用本文中所描述的方法来测定富含GC的基因座的甲基化状态。在一些情况中，富含GC的区域的扩充与各种疾病状态有关。与CGG重复扩充有关的基因座的例子是X染色体上脆性X智力低下-1基因(FMR1)的5’非翻译区(UTR)。此区域中扩充成大于200个CGG重复与FMR1基因的超甲基化有关，并且称为“完全突变”等位基因。这些等位基因与FMR1蛋白生成的损失及病症脆性X综合征(FXS)有关。FXS可以包括智力低下、孤独症、卵巢功能早衰、及其它认知和行为状态。(J.Mol Diag.10(6):496-501(2008))。

用于测定富含GC的模板和FMR1的甲基化状态的方法包括Southern印迹(SB)分析和聚合酶链式反应(PCR)策略。SB分析提供了三联体重复区的大小的粗略测量和甲基化的评估。可以使用甲基化敏感性酶(其不切割甲基化位点)来区别甲基化的和未甲基化的等位基因。然而，通过SB分析测定甲基化状态限于通过凝胶电泳充分解析的等位基因。SB分析还受到需要的基因组DNA(gDNA)材料的量和与高通量规程不相容的繁重工作流限制。(Genet.Med.7(8):584-587(2005))。

PCR策略可以在测定三联体重复区的大小中提供较大的准确性。然而，扩增富含GC的长序列(包括FMR1 5’UTR的完全突变等位基因)中的限制已经约束重复区的量化。例如，已经尝试了对FMR1PCR的优化，并且其包括对常规PCR测定条件的修改。(见Genome Res.6(7):633-8,(1996)；J.Mol.Diagn.8:544-550,(2006)；及Am J Med Genet.51(4):527-34,(1994))。新近，已经开发出允许可靠扩增超过200个CGG重复的PCR技术。见美国申请No.2010/0209970，其通过提述完整并入本文。然而，单独的PCR不允许表征富含GC的模板的甲基化状态。

几种策略组合PCR与用于评估甲基化的其它方法。大多数方法已经利用5-甲基胞嘧啶对亚硫酸氢盐转化(bisulfite conversion)的抗性以揭示甲基化状态。然而，对于FMR1，例如，基于亚硫酸氢盐的甲基化PCR方法实际上已经限于仅评估男性样品，这是由于混淆女性样品解读的混合甲基化状态，和/或所述方法已经表明对扩充等位基因的有限效用。(见Hum.Mutation 14:71-79,(1999)；Clin.Chem.52:1492-1500,(2006)；J.Med.Genet.41:1-8,(2004)；及Hum.Genet.108:450-458,(2001))。已经报告了亚硫酸氢盐处理的备选，诸如使用甲基化敏感性限制酶，然而，对女性样品的分析仍然是有问题的。(J.Mol Diag.10(6):496-501,(2008))。

至今，除了SB外没有单一办法在男性和女性样品两者中表明对扩充等位基因的精确甲基化评估。因此，需要可以用于表征富含GC的基因座的甲基化和重复状态的快速的、精确的、具有简单工作流的测定法。

本文中所描述的方法涉及基于PCR的技术，其可以在男性和女性样品两者中检测并解析富含GC的重复长度范围间的甲基化状态。总体工作流适合于常规测试和高通量筛选应用，并且为不需要SB分析的全面FMR1分析提供基础。

在一个实施方案中，所述方法涉及表征DNA样品中的FMR基因座，包括下列步骤：

a)使所述样品的第一部分与甲基化敏感性DNA酶接触；

b)将GC参照标准品添加至所述样品，其中所述参照标准品具有至少75％GC丰度；