[发明专利]心肌细胞培养液及培养方法

权利要求书

1.一种基于外周血单核细胞的心肌细胞培养液，其特征在于，所述培养液由：体积比为100:0.8～1.8的DMEM/F12基础培养基和胰岛素转铁蛋白亚硒酸盐补充液、腺苷酸环化酶激活剂、L-抗坏血酸、L-谷氨酰胺、钙通道激活剂、RSK 2抑制剂、GSK 3抑制剂、ALK-4,5,7抑制剂和纤维母细胞生长因子组成；所述腺苷酸环化酶激活剂为毛喉素；所述钙通道激活剂为Bay K 8644；所述RSK 2抑制剂为AT7867或BI-D1870；所述GSK 3抑制剂为SB216763或SB415286；所述ALK-4,5,7抑制剂为SB505124；所述腺苷酸环化酶激活剂浓度为4～10μmol/L；所述L-抗坏血酸浓度为0.08～0.14mmol/L，所述L-谷氨酰胺浓度为4～15mmol/L，所述钙通道激活剂浓度为20～80nmol/L，所述RSK 2抑制剂浓度为30～150nmol/L，所述GSK 3抑制剂浓度为60～150nmol/L，所述ALK-4,5,7抑制剂浓度为50～200nmol/L，所述纤维母细胞生长因子浓度为0.6～0.18mmol/L。

2.如权利要求1所述的培养液，其特征在于，DMEM/F12基础培养基和胰岛素转铁蛋白亚硒酸盐补充液的体积比为100:1～1.5；所述腺苷酸环化酶激活剂浓度为6～8μmol/L；所述L-抗坏血酸浓度为0.09～0.12mmol/L；所述L-谷氨酰胺浓度为8～10mmol/L；所述钙通道激活剂浓度为50～60nmol/L；所述RSK 2抑制剂浓度为80～100nmol/L；所述GSK 3抑制剂浓度为80～100nmol/L；所述ALK-4,5,7抑制剂浓度为100～150nmol/L；纤维母细胞生长因子浓度为0.10～0.15mmol/L。

3.如权利要求2所述的培养液，其特征在于，DMEM/F12基础培养基和胰岛素转铁蛋白亚硒酸盐补充液的体积比为100:1；所述腺苷酸环化酶激活剂浓度为6μmol/L；所述L-抗坏血酸浓度为0.10mmol/L；所述L-谷氨酰胺浓度为10mmol/L；所述钙通道激活剂浓度为50nmol/L；所述RSK 2抑制剂浓度为80nmol/L；所述GSK 3抑制剂浓度为100nmol/L；所述ALK-4,5,7抑制剂浓度为150nmol/L；所述纤维母细胞生长因子浓度为0.15mmol/L。

4.一种由外周血单核细胞培养心肌细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用权利要求1～3任一项所述的培养液对外周血单核细胞进行培养得到原代培养物；

2)原代培养物用所述培养液进行分化培养15～20天得到心肌细胞。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：

步骤1)具体为，于35～39℃、3～7％CO₂条件下，用所述培养液对外周血单核细胞进行原代培养2～5天，原代培养期间不用更换培养液；

步骤2)具体为，将步骤1)得到的原代培养物消化下来，于35～39℃、3～7％CO₂条件下用所述培养液进行分化培养15～20天得到心肌细胞，分化培养期间每隔1～3天更换一次培养液。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：

步骤1)具体为，于37℃、5％CO₂条件下，用所述培养液对外周血单核细胞进行原代培养3天，原代培养期间不用更换培养液；

步骤2)具体为，将步骤1)得到的原代培养物消化下来，于37℃、5％CO₂条件下用所述培养液进行分化培养15～20天得到心肌细胞，分化培养期间每隔1天更换一次培养液。

7.如权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述外周血单核细胞用Ficoll-Paque密度梯度离心法分离患者血样得到。