[发明专利]心肌细胞培养液及培养方法

说明书

本发明公开了一种基于外周血单核细胞培养心肌细胞的培养液，所述培养液包括：体积比为100:0.5～2的DMEM/F12基础培养基和胰岛素转铁蛋白亚硒酸盐(ITS)补充液、腺苷酸环化酶激活剂、L‑抗坏血酸、L‑谷氨酰胺衍生物、钙通道激活剂、RSK 2抑制剂、GSK 3抑制剂和ALK‑4,5,7抑制剂。本发明还公开了一种基于外周血单核细胞培养心肌细胞的培养方法，使用所述培养液，可以外周血单核细胞为原料定向分化培养得到心肌细胞，取材方便，可避免道德争议。

技术领域

本发明属于心肌细胞培养技术领域，具体涉及一种心肌细胞的培养液及培养方法。

背景技术

心血管疾病一直是人类的重大疾病之一。心肌细胞在心血管疾病的体外疾病模型、药物筛选、药物毒理测试等方面都有应用。但是由于心肌细胞增殖能力有限、原代心肌细胞取样困难，因此体外心肌细胞模型仍然难以大规模应用。目前用于体外心肌模型的心肌细胞主要有以下几种来源：

胚胎源心肌细胞：主要是胚胎干细胞(ESCs)诱导分化得到的心肌细胞。但是人胚胎来源的心肌细胞十分有限，目前主要是从流产人胚胎组织中获取，一直受到争议。另外，免疫排斥及致癌作用一直限制其使用。因此，胚胎源心肌细胞应用于临床在来源及效果方面也有很大的障碍。

组织来源的心肌细胞：目前组织来源的心肌细胞只是用动物来源的心肌细胞，活体人心脏组织无法获得。而动物心肌细胞的研究模型与人体本身有差异，研究成果仍然难以在人类自身直接应用。

综上心肌细胞的来源往往受到现有技术或伦理的限制，从而影响心肌细胞在临床中治疗心血管疾病的应用和研究。

发明内容

因此，本发明针对现有技术中心肌细胞的来源受到限制的技术问题，目的在于提供一种更加方便取材，可避免道德争议的基于外周血单核细胞(PBMC)培养心肌细胞的定向分化培养液。

本发明的基于外周血单核细胞的心肌细胞培养液包括：体积比为100:0.5～2的DMEM/F12基础培养基和胰岛素转铁蛋白亚硒酸盐(ITS)补充液(购自Sigma公司，货号I3146)、腺苷酸环化酶激活剂、L-抗坏血酸、L-谷氨酰胺、钙通道激活剂、RSK 2抑制剂、GSK3抑制剂、ALK-4,5,7抑制剂。

其中，所述腺苷酸环化酶激活剂选用毛喉素(Forskolin)，用于通透细胞，激活腺苷酸环化酶，从而升高细胞内的cAMP水平。L-抗坏血酸作为培养基中的生长因子。L-谷氨酰胺作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。所述钙通道激活剂可选用BayK 8644(中文名：1,4-二氢-2,6-二甲基-5-硝基-4-(2-[三氟甲基]苯基)吡啶-3-羧酸甲酯，CAS号：71145-03-4)；所述RSK 2抑制剂可选用AT7867(中文名：4-(4-(1氢-吡唑-4-基)苯基)-4-(4-氯苯基)哌啶，CAS号：857531-00-1)或BI-D1870(中文名：2-[(3,5-二氟-4-羟基苯基)氨基]-7,8-二氢-5,7-二甲基-8-(3-甲基丁基)-6(5H)-蝶啶酮，CAS号：501437-28-1)；所述GSK 3抑制剂可选用SB216763(中文名：3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1氢-吲哚-3-基)-1氢-吡咯-2,5-二酮，CAS号：280744-09-4)或SB415286(中文名：3-[(3-氯-4-羟苯基)氨基]-4-(2-硝苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮，CAS号：264218-23-7)；所述ALK-4,5,7抑制剂可选用SB505124(中文名：2-(5-二烷基[1,3]二氧环戊-5-基-2-叔丁基-3氢-咪唑-4-基)-6-盐酸甲基吡啶，CAS号：694433-59-5)或SB431542(中文名：4-[4-(1,3-苯并二唑-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]-苯酰胺水合物，CAS号：301836-41-9)。