[发明专利]一种可溶性水通道蛋白AqpZ融合载体及其构建方法

说明书

本发明公开了一种可溶性水通道蛋白AqpZ融合载体及其构建方法。本发明利用除去信号肽的麦芽糖结合蛋白ΔMBP作为N端亲水性标签，利用截短的人类载脂蛋白ApoAI*作为C端两亲性标签，利用C端His作为纯化和检测标签，构建pET28a‑ΔMBP‑AqpZ‑ApoAI*‑His重组载体。本发明实现了原为脂溶性的水通道蛋白的水溶化，在不需要借助去污剂的条件下，将其溶解在水相中，同时显著提高了水通道蛋白的表达量，适用于工业化生产。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种可溶性水通道蛋白AqpZ融合载体及其构建方法。

背景技术

水通道蛋白作为一类重要的通道蛋白，对维持细胞内外渗透压平衡起着关键作用。了解其结构能够帮助研究者更好的阐明水通道蛋白的工作机制。由于水通道蛋白的低丰度，研究者很难得到足够量的样品以供后续分析；不仅如此，水通道蛋白有着很强的疏水性，因此必须借助去污剂将其从膜环境中溶解到水环境中，而去污剂的引入在一定程度上会改变水通道蛋白的天然构象，对分析造成困难。

文献《Applied Microbiology and Biotechnology March 2009,Volume 82,Issue 3,pp 463–470》报道了利用融合表达的方法提高水通道蛋白的表达量，但其方法得到的表达量并没有数量级上的提高，且仍然需要使用去污剂将水通道蛋白从膜环境中溶解到水环境中。《Biological Chemistry Volume 390,Issue 8(Aug 2009)》报道了利用纳米磷脂盘研究膜蛋白，解决了去污剂的问题。但使用纳米磷脂盘必须要脂质的参与，引入了一定程度的不确定性。因此，如何提高水通道蛋白表达量的同时，消除去污剂对后续分析的影响，仍然是一个亟待解决的问题。

发明内容

本发明提供了一种可溶性水通道蛋白AqpZ可溶性融合载体，所述的载体利用除去N端信号肽的麦芽糖结合蛋白作为亲水性标签和利用截短的人类载脂蛋白包裹水通道蛋白AqpZ，不仅能够提高水通道蛋白的表达量，而且实现了水通道蛋白AqpZ的可溶性表达。

本发明的技术解决方案如下：

一种可溶性水通道蛋白AqpZ融合载体，为利用PCR扩增pMBP-p质粒，得到除去N端信号肽的麦芽糖结合蛋白cDNA即ΔMBP，将ΔMBP整合到pET28a质粒中得到pET28a-ΔMBP载体；PCR扩增pET28a-ApoAI质粒，得到截短的人类载脂蛋白cDNA即ApoAI*，将ApoAI*整合到pET28a-ΔMBP载体中得到pET28a-ΔMBP-ApoAI*-His载体；PCR扩增大肠杆菌基因组DNA，得到水通道蛋白AqpZ的cDNA即AqpZ，将AqpZ整合到pET28a-ΔMBP-ApoAI*-His载体中得到pET28a-ΔMBP-AqpZ-ApoAI*-His载体。

本发明进一步提供上述可溶性水通道蛋白AqpZ融合载体的构建方法，具体步骤如下：

步骤1，先将pMBP-p质粒进行PCR，得到除去N端信号肽的麦芽糖结合蛋白cDNA即ΔMBP，用NcoⅠ限制性核酸内切酶和NdeⅠ限制性核酸内切酶对ΔMBP和pET28a质粒进行酶切，连接反应得到pET28a-ΔMBP载体；

步骤2，将pET28a-ApoAI质粒进行PCR，得到截短的人类载脂蛋白cDNA即ApoAI*，用HindⅢ限制性核酸内切酶和NotⅠ限制性核酸内切酶对ApoAI*和pET28a-ΔMBP质粒进行酶切，在ApoAI*末端无终止子的情况下，引入pET28a本身所带的His标签，连接反应得到pET28a-ΔMBP-ApoAI*-His载体；

步骤3，对大肠杆菌基因组DNA进行PCR反应，得到水通道蛋白AqpZ的cDNA即AqpZ，用NdeⅠ限制性核酸内切酶和HindⅢ限制性核酸内切酶对AqpZ和pET28a-ΔMBP-ApoAI*-His质粒进行酶切，连接反应得到pET28a-ΔMBP-AqpZ-ApoAI*-His载体。