[发明专利]抗菌肽融合蛋白及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程、生物技术制药工程技术领域，具体涉及一种抗菌肽融合蛋白及其制备方法，以及该融合蛋白在制备抗菌药物中的应用。

背景技术

抗菌肽(Antimicrobial peptides.AMPs)是生物体在受到病原微生物侵袭时自身诱导产生的一类具有抗菌活性的小分子多肽，是天然免疫的主要成分,一般由20-60个氨基酸残基组成,耐高温、耐酸、水溶性好、抗菌谱广、抗菌机制特殊、杀菌快速且不产生耐药性。很多抗菌肽不仅能在较低浓度下有效抑制细菌、病毒、真菌和原虫等多种病原微生物的生长，甚至还可以杀死肿瘤细胞,而对正常的没有发生病变的真核细胞几乎没有作用。在医药行业上，抗菌肽的应用最为广泛，发展前景最好，目前科研人员在这一领域取得了丰硕的成果，如：美国马盖宁公司经过设计改造过的抗菌肽magainin对病毒和肿瘤细胞均有较好的杀伤作用；邓小娟从柞蚕中提取的抗菌肽对耐药性很强的金黄色葡萄球菌有杀菌作用。在临床应用上，抗菌肽可用于抗感染、抗病毒和抗肿瘤和提高免疫力等。已经在俄罗斯上市的抗菌肽Glutoxim可用于结核病的辅助治疗，可以提高结核双歧杆菌的清除率，缩短治疗时间，减少不良反应。已进入III期临床试验阶段的抗菌肽DiaPep277可用于糖尿病的治疗。DiaPep277通过对免疫系统进行调节，使胰岛B细胞免受自身免疫系统的破坏，从而有效控制病情。在食品工业上，抗菌肽可以作为食品保藏剂添加到食品中，减少有害防腐剂的使用。乳酸链球菌素(Nisin)是抗菌肽在食品中应用的最典型代表。抗菌肽还可以作为食品适量增效剂，如：LL-37可以作为趋化因子或细胞因子诱导剂而发挥免疫调节作用。在禽畜养殖业上，抗菌肽成为新型饲料添加剂进入人们的视野。在动物饲料中添加抗菌肽可以抑制病菌繁殖，改善动物肠道菌群结构，提高动物生产性能，如：在仔猪饲料添加抗菌肽能够增加肠道益生菌数量，控制腹泻率，提高仔猪生长性能，从而提高成活率。在水产养殖业上，水生生物抗菌肽的高效抗病毒、抗菌作用等为水产养殖的抗病害问题提供了新的解决方案。国内在水产养殖方面的研究已有很多报道，如：利用毕车酵母表达系统表达贻贝抗菌肽等。

天蚕素抗菌肽(cecropins)属于阳离子抗菌肽家族中重要一族，最早于瑞典科学家Boman等用阴沟通杆菌及大肠杆菌诱导惜古比天蚕(Hyalophora cecropia)蛹后发现。Boman等又进一步测定了天蚕素抗菌肽A和B的一级结构，随后天蚕素抗菌肽相继被分离、纯化，并且其氨基酸的结构特征和基因序列得到确定。到目前为止，天蚕素抗菌肽共有A、B、C、D、E5种结构，另外还发现多种类似物。天蚕素抗菌肽是世界上发现最早、研究最彻底、效果最明显的一类抗菌肽，是昆虫非特异性免疫系统的重要组成部分，一般由31～39个氨基酸组成，分子量约为3.5～4KD左右，其分子结构相对保守，主要由α螺旋构成，属于α螺旋类抗菌肽。这类抗菌肽热稳定性好、无免疫原性、抗菌能力强，能有效抑制格兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长。

研究发现，天蚕素抗菌肽对一些真核细胞不具毒性作用，如家蚕cecropin A和cecropin B能够抑制并杀死白色念珠菌，但对人体细胞株Jurkat没有毒性，即使在高浓度下，也不会使真核生物的红血球发生溶解破裂。除此之外，天蚕素抗菌肽具有抗病毒活性，抗寄生虫和原虫作用，抗肿瘤活性，具有免疫调节，促中性粒细胞、T细胞的化学趋势，促进伤口愈合等作用。目前，天蚕素抗菌肽已应用在动植物的生产和培育方面等，如：将天蚕素抗菌肽转入粮食作物、经济作物、果树、蔬菜等植物中，可以培育出抗病能力强的植物新品种；在动物日粮中添加天蚕素抗菌肽能够提高动物的生长性能，增强免疫力，改善动物肠道结构，促进免疫器官发育，提高免疫器官指数，提高免疫力，控制炎性反应，改善动物肠道菌群，减少应激，改善饲料转化率。

但是目前抗菌肽大多都是单独存在而发挥其抗菌功能，对不同菌株的杀菌能力还是存在一定的局限性，且抗菌活性也有待提高。现代研究认为：目前最具潜力成为抗生素替代品的是抗菌肽。天蚕素是目前研究比较清楚的抗菌肽。由于人工合成抗菌肽的技术瓶颈多、工艺复杂，而且合成成本昂贵，不适宜大规模生产。单一提纯物在使用时还可能具有溶血性问题，所以现在应用在人上的天蚕素抗菌肽基本上都是通过诱导家蚕或柞蚕产生的天蚕素与这些物质的初级混合物，作为保健食品使用，其中含有的天蚕素抗菌肽是极微的。

发明内容