[发明专利]一种原代小鼠肝实质细胞的冻存方法在审
| 申请号： | 201611253844.2 | 申请日： | 2016-12-30 |
| 公开（公告）号： | CN108260586A | 公开（公告）日： | 2018-07-10 |
| 发明（设计）人： | 不公告发明人 | 申请（专利权）人： | 江苏齐氏生物科技有限公司 |
| 主分类号： | A01N1/02 | 分类号： | A01N1/02 |
| 代理公司： | 暂无信息 | 代理人： | 暂无信息 |
| 地址： | 214434 江苏省无锡市江阴市东*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 实质细胞 小鼠肝 冻存 肝实质细胞 小鼠 冻存液 成活率 复苏 细胞 分离小鼠 活性测定 形态观察 逐级降温 冻存管 灌流 重悬 配制 检测 | ||
1.一种小鼠原代肝实质细胞的冻存方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）小鼠原代肝实质细胞冻存液的配制；（2）两步灌流法分离小鼠肝实质细胞；（3）冻存液重悬小鼠肝实质细胞后加入冻存管中；（4）采用逐级降温法冻存小鼠肝实质细胞（5）小鼠肝实质细胞的复苏；（6）TB拒染法测定小鼠肝实质细胞成活率；（7）酶指标活性测定；（8）小鼠肝实质细胞形态观察；（9）ELISA法检测；（10）RT-PCR检测。
2.根据权利要求1所述的小鼠原代肝实质细胞的冻存方法，其特征在于步骤（1）所述冻存液含30%~90%H-DMEM培养基，40%~80%胎牛血清，5%~20%二甲基亚砜，1~4 mM谷氨酰胺，20~60 ng/ml地塞米松，100~200 ng/ml肝原代细胞生长因子，1.0~2.0 mmol CaCl2。
3.根据权利要求1所述的小鼠肝实质细胞的冻存方法，其特征在于步骤（2）所述两步灌流法为HBSS缓冲液和胶原酶溶液原位两步灌流法，灌流速度5~15 ml/min。
4.根据权利要求3所述的小鼠肝实质细胞的冻存方法，其特征在于步骤（2）所述两步灌流法中胶原酶溶液为0.1%~0.5%的Ⅳ型胶原酶溶液。
5.根据权利要求1所述的小鼠肝实质细胞的冻存方法，其特征在于步骤（3）所述冻存液重悬肝实质细胞浓度为4~6×106个细胞/ml，每个冻存管加入1~2 ml冻存液。
6.根据权利要求1所述的小鼠肝实质细胞的冻存方法，其特征在于步骤（4）所述逐级降温法是将冻存管放入逐级降温冻存盒中，在-80 ℃冰箱冻存4~8 h，再置于液氮罐保存冻存15 d、30 d、45 d、60 d。
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