[发明专利]一种原代小鼠肝实质细胞的冻存方法

说明书

本发明提供了一种小鼠原代肝实质细胞的冻存方法，包括以下步骤：1）小鼠肝实质细胞冻存液的配制；（2）两步灌流法分离小鼠肝实质细胞；（3）冻存液重悬小鼠肝实质细胞后加入冻存管中；（4）采用逐级降温法冻存小鼠肝实质细胞（5）小鼠肝实质细胞的复苏；（6）TB拒染法测定小鼠肝实质细胞成活率；（7）酶指标活性测定；（8）小鼠肝实质细胞形态观察；（9）ELISA法检测；（10）RT‑PCR检测。本发明提供的一种小鼠原代肝实质细胞的冻存方法，操作简单，冻存复苏后所得细胞数量多，成活率高，是一种理想的小鼠原代肝实质细胞的冻存方法，为实验提供可靠的细胞资源。

技术领域

本发明属于现代生物技术之细胞培养技术领域，具体涉及一种小鼠原代肝实质细胞的冻存方法。

背景技术

肝实质细胞作为细胞移植治疗慢性肝衰竭的种子细胞以及作为药物筛选的靶细胞，制备和培养大规模的、高活力的肝细胞是这些研究的最基本环节。因此肝实质细胞的分离、培养和冻存技术正日益受到人们关注，成为当前研究的热点。

肝实质细胞对外界条件非常敏感，对冻存耐受力差，冻存及复苏的过程造成的各种化学及物理损伤均可能影响肝细胞的活力及功能。肝实质细胞低温保存技术已研究多年，目前还未探索一种理想的肝实质细胞冻存方法。合适的冻存液将有效帮助肝实质细胞在冻存过程中抵抗渗透压的变化，减少肝实质细胞冻存过程中的损伤。目前有人用UW液冻存肝实质细胞，但UW液价格昂贵，只能短期低温保存肝实质细胞，长期冻存效果欠理想。因此，急需建立一种简单、高效的冻存小鼠原代肝实质细胞的技术。

本发明在传统低温保存肝细胞技术基础上，旨在提供一种操作简单、高效的获得生长状态好、纯度高的小鼠原代肝实质细胞的冻存方法，建立一套完善可靠的小鼠原代肝实质细胞体外冻存技术。

发明内容

根据上述问题，本发明提供了一种小鼠原代肝实质细胞的冻存方法，该方法操作简单，细胞复苏活性好，成活率高，是一种较为理想的小鼠原代肝实质细胞的冻存方法，可以满足多种生理生化实验的要求。

一种小鼠原代肝实质细胞的冻存方法步骤包括：（1）小鼠肝实质细胞冻存液的配制；（2）两步灌流法分离小鼠肝实质细胞；（3）用配制好的冻存液重悬小鼠肝实质细胞后加入冻存管中；（4）采用逐级降温法冻存小鼠肝实质细胞（5）小鼠肝实质细胞的复苏；（6）TB拒染法测定小鼠肝实质细胞成活率；（7）酶指标活性测定；（8）小鼠肝实质细胞形态观察；（9）ELISA法检测；（10）RT-PCR检测。

其中，步骤 （1）小鼠肝实质细胞冻存液含30%~90%H-DMEM培养基，40%~80%胎牛血清，5%~20%二甲基亚砜，1~4 mM谷氨酰胺，20~60 ng/ml地塞米松，100~200 ng/ml肝原代细胞生长因子，1.0~2.0 mmol CaCl₂。

其中，步骤 （3） 所述冻存液按照4~6×10⁶个细胞/ml重悬细胞，每个冻存管加入1~2 ml冻存液。

其中，步骤（4）所述逐级降温法是将冻存管放入逐级降温冻存盒中，在-80 ℃冰箱冻存4~8h，再置于液氮罐保存冻存15 d、30 d、45 d、60 d。

其中，步骤（5）所述小鼠肝实质细胞的复苏是将各组冻存的肝细胞置于37 ℃水浴锅中迅速晃动使其快速融化。

有益效果

与现有冻存技术相比，本发明建立了一种简单、高效的小鼠原代肝实质细胞的冻存方法，所得原代细胞复苏后经细胞形态学观察与酶活测定：数量多、纯度高、活性好，细胞成活率均达85%以上，细胞纯度均达96%以上。