[发明专利]一种监测土壤中油气微生物的方法

权利要求书

1.一种监测土壤中油气微生物的方法，其包括如下步骤：

步骤一：以靶标基因的标准品作为DNA模板、以SYBR Green作为染料以及以能够扩增所述靶标基因上任意选取的一段序列的两条核酸序列作为上游引物和下游引物进行实时荧光定量PCR；以提取的待测土样中的总DNA作为DNA模板，以所述SYBR Green作为染料以及以所述两条核酸序列作为上游引物和下游引物进行实时荧光定量PCR；

步骤二：根据所述靶标基因的标准品作为DNA模板获得的实时荧光定量PCR结果建立靶标基因的标准曲线，并根据所述标准曲线确定所述待测土样中的靶标基因的拷贝数。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶标基因包括alkB基因。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，用于扩增所述alkB基因的引物对包括如SEQ ID No.1所示的上游引物序列，和如SEQ ID No.2所示的下游引物序列。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其特征在于，使用含有所述SYBR Green的SYBR Premix Ex Taq Perfect Real Time试剂盒来进行实时荧光定量PCR。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的配制的体系为：1倍体积的SYBR Premix Ex Taq Perfect Real Time，分别为15-25μmol·L^-1的上游引物和下游引物，1-10ng的DNA模板，和余量的水。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的配制的总体系为20μl，各组分的加入量分别为：10μl SYBR Premix Ex Taq Perfect Real Time，分别为16-20μmol·L^-1的上游引物和下游引物，3-5ng的DNA模板，和余量的水。

7.根据权利要求1-6中任意一项所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的扩增条件为：1)92-98℃25-35s；2)92-98℃7-13s，3)50-60℃25-35s，4)70-74℃25-35s，5)77-83℃3-7s，6)从步骤2)至步骤5)循环30-45次；7)62-68℃3-7s；

优选1)95℃30s；2)95℃10s，3)55℃30s，4)72℃30s，5)80℃5s，6)从步骤2)至步骤5)循环35-42次；7)65℃5s。

8.根据权利要求1-7中任意一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在步骤一之前的步骤A：制备靶标基因的实时荧光定量PCR的标准品。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述靶标基因实时荧光定量PCR的标准品制备步骤如下：

I)将所述靶标基因进行克隆，获得存在于宿主细胞中的含有所述靶标基因的克隆载体；

II)从宿主细胞提取所述步骤I)中的所述克隆载体，并使所述克隆载体线性化；

III)采用光度适应计测定线性化的克隆载体的溶液的浓度，然后对所述性化的克隆载体的溶液进行稀释，获得至少三个不同浓度的线性化的克隆载体的溶液来构成所述靶标基因的标准品。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，