[发明专利]一种监测土壤中油气微生物的方法

说明书

本发明涉及油气微生物的监测技术领域。其包括如下步骤：步骤一：以靶标基因的标准品作为DNA模板、以SYBR Green作为染料以及以能够扩增所述靶标基因上任意选取的一段序列的两条核酸序列作为上游引物和下游引物进行实时荧光定量PCR；以提取的待测土样中的总DNA作为DNA模板，以所述SYBR Green作为染料以及以所述两条核酸序列作为上游引物和下游引物进行实时荧光定量PCR；步骤二：根据所述靶标基因的标准品作为DNA模板获得的实时荧光定量PCR结果建立靶标基因的标准曲线，并根据所述标准曲线确定所述待测土样中的靶标基因的拷贝数。从而实现靶标基因的定量准确，以及快速和高通量测监测。

技术领域

本发明涉及油气微生物的监测技术领域，尤其是alkB基因的实时荧光定量PCR。

背景技术

油气微生物勘探法主要研究近地表土壤层中微生物异常与地下深部油气藏的相互关系。在现代勘探法中，微生物法能为初期勘探提供廉价有效的方法，指示和预测有利勘探区块以降低勘探风险。

传统的微生物勘探主要以培养法为主，在已公开的技术中(CN 102453746 B)，已有使用培养法对土壤样品中专性烃氧化菌的检测方法，检测的时间相对较长，培养期为3-5天，优点是检测通量较高及较低的实施难度和成本，缺点是耗时较长，不能检测不可培养的烃氧化菌，同时特异性较低，计数使用平板法、MPN法，定量不准确。

因此需要开发出一种能够克服上述缺点的靶标基因的监测方法。

发明内容

本发明包含的是一种用于微生物油气勘探的alkB基因实时荧光定量PCR检测方法。主要包括：提取环境样品细菌总DNA，使用特定的PCR反应引物和探针进行alkB基因扩增；使用特定载物和反应条件构建定量PCR标准品；用特异性引物和荧光分子探针对标准品和总DNA进行定量PCR扩增，构建烃氧化菌alkB基因的标准曲线，建立针对alkB基因的实时定量PCR检测方法。

因此，本发明提供了一种监测土壤中油气微生物的方法，其包括如下步骤：步骤一：以靶标基因的标准品作为DNA模板、以SYBR Green作为染料以及以能够扩增所述靶标基因上任意选取的一段序列的两条核酸序列作为上游引物和下游引物进行实时荧光定量PCR；以提取的待测土样中的总DNA作为DNA模板，以所述SYBR Green作为染料以及以所述两条核酸序列作为上游引物和下游引物进行实时荧光定量PCR；步骤二：根据所述靶标基因的标准品作为DNA模板获得的实时荧光定量PCR结果建立靶标基因的标准曲线，并根据所述标准曲线确定所述待测土样中的靶标基因的拷贝数。其中，油气微生物可以为能够降解C5-C13范围汽油烃的微生物。

通过使用本发明的靶标基因监测的方法，克服了现有技术中检测耗时长，不能检测不可培养的烃氧化菌，特异性较低，以及定量不准确的缺点。利用本发明的实时定量PCR技术扩增甲烷(烃)氧化菌的功能基因检测其存在和数量，具有快速、灵敏、高通量、特异性强、自动化程度高、重复性好、准确定量等特点。该方法已经在油气微生物勘探技术及应用研究等项目中得到了应用，为微生物勘探技术的工业化应用奠定了基础。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述油气微生物是指烃氧化微生物，尤其是烃氧化菌，例如丁烷氧化菌。

在一个具体实施例中，所述靶标基因包括alkB基因。