[发明专利]一种耐热耐酸葡萄糖氧化酶的发酵制备及分离纯化方法

权利要求书

1.一种嗜热拟青霉产耐热耐酸的葡萄糖氧化酶的发酵制备及分离纯化方法，包括发酵制备方法和分离纯化方法，所述发酵制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

（1）将嗜热拟青霉菌种在PDA活化培养基平板上划线活化，并将PDA活化培养基平板置于30～40℃的恒温培养箱中活化培养48～72h，即得嗜热拟青霉丝；所述嗜热拟青霉菌种已于2016年11月11日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.13182；

（2）用接种环刮取步骤（1）中所制备的嗜热拟青霉丝接种于斜面培养基上，并将斜面培养基置于30～40℃的条件下培养2～4d，即得孢子；

（3）将步骤（2）中所制备的孢子用含有0.01%（v/v）吐温80的0.75%无菌生理盐水清洗孢子，将清洗后的孢子放入盛有50～55mL无菌生理盐水和无菌玻璃珠的锥形瓶中并充分振荡30～45min，待孢子充分分散后，制备孢子含量为1.0×10⁸CFU/mL的孢子悬液，即得单孢子菌悬液；

（4）将步骤（3）中所制备的单孢子菌悬液以4～8%（v/v）的接种量接入装有30～50mL种子培养基的三角瓶中，三角瓶在转速为160～200r/min、温度为30～45的条件下，摇床培养18～24h，即得嗜热拟青霉种子培养液；

（5）将步骤（4）中所制备的嗜热拟青霉种子培养液以6～10%（v/v）的接种量接入装有150～200mL摇瓶发酵培养基的三角瓶中，三角瓶采用6层纱布封口，将封口的三角瓶在转速为160～200r/min、温度为40～45℃的条件下摇床发酵30～48h，即得嗜热拟青霉发酵培养液；

（6）将60～100mL的发酵补充营养液加入步骤（5）中所制备的嗜热拟青霉发酵培养液中，即得发酵液一，待发酵液一温度降至37～40℃时，调节发酵液一的pH为5～6，并继续振动发酵，待发酵时间达72h时、温度降至28～32℃，再次向发酵液一中加入50～80mL的发酵补充营养液，并继续发酵24～48h，即得发酵液二；

（7）将步骤（6）中所制备的发酵液二经4层纱布过滤，得菌丝和滤液，将滤液在转速为8000r/min的条件下离心20～30min，得沉淀和上清液，将上清液用超滤膜超滤2次，即得截留液，将所得截留液浓缩3～4倍，即得浓缩液，将所得浓缩液在60～70℃条件下旋转蒸发仪抽真空浓缩，即得粗酶液；

（8）将1～2wt%的糊精、2～4wt%的可溶性淀粉和0.1～0.2wt%的山梨酸钾加入步骤（7）中所制备的粗酶液中，并搅拌均匀，即得葡萄糖氧化酶溶液，将葡萄糖氧化酶溶液置于-20℃冷冻6～8h，将冷冻后的葡萄糖氧化酶溶液置于真空度35～45Pa、温度为-35℃的条件下，冷冻干燥15～20h并粉碎，即得葡萄糖氧化酶酶制剂；

所述分离纯化方法，具体步骤如下：

（1）将嗜热拟青霉发酵培养液在8000r/min的条件下，离心20～30min，弃沉淀保留上清液，将上清液加热至80℃，保温20～30min，待上清液冷却至室温后放置4℃的条件下静置6～8h，将静置后的上清液置于8000r/min的条件下，离心20～30min，去掉沉淀下的杂蛋白；所述嗜热拟青霉菌种已于2016年11月11日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.13182；

（2）向热处理后的葡萄糖氧化酶粗酶液中加入硫酸铵，至饱和度达到30～40％，并调节其pH为6.5～7.0，在4℃下的条件下，静置24～28h后，在8000r/min的条件下，离心20～40min，弃沉淀保留上清液，向上清液中加入50～70％的无水乙醇，并调节其pH为5.5～6.0，4℃下静置24h后，于8000r/min的条件下，冷冻离心20～35min，弃上清液，将沉淀用去离子水溶解，并充分透析脱盐；

（3）透析脱盐后的酶液，上样至经Tris-HCl缓冲液平衡的DEAE-Sephadex A-50离子交换柱，上样后用Tris-HCl缓冲液充分淋洗至A280不发生变化，然后采用含0～0.5mol/LNaCl的Tris-HCl缓冲液以1～1.5mL/min流速进行线性梯度洗脱，每管收集3mL；

（4）将上述分离纯化的酶液，上样至经0.05mo1/L pH为6.0磷酸盐缓冲液平衡的Sephadex G-100凝胶层析柱，采用0.05mol/L pH 6.0 磷酸盐缓冲液以0.5mL/min流速进行洗脱，每管收集2mL。