[发明专利]一种耐热耐酸葡萄糖氧化酶的发酵制备及分离纯化方法

说明书

本发明公开了一种耐热耐酸葡萄糖氧化酶的发酵制备及分离纯化方法，属于微生物技术领域。该发酵制备得到葡萄糖氧化酶具有高的耐热性和耐酸性，解决了在食品及饲料中因高温及酸性环境中使用导致的酶活力低的缺陷。具体步骤如下：将菌种培养成孢子并将孢子清洗后制备单孢子菌悬液；将单孢子菌悬液接入种子培养基中发酵培养；将种子培养液接入摇瓶发酵培养基中发酵培养，将发酵补充营养液加入发酵液中；糊精、可溶性淀粉及山梨酸钾加入发酵液中并搅拌均匀，将发酵液冷冻，干燥并粉碎，得葡萄糖氧化酶。发酵得到的葡萄糖氧化酶粗酶液经过热处理、硫酸铵‑乙醇复合沉淀及离子交换层析和分子筛凝胶过滤层析，得到高回收率高纯度的葡萄糖氧化酶。

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种耐热耐酸葡萄糖氧化酶的发酵制备及分离纯化方法。

背景技术

葡萄糖氧化酶是酶技术领域中一种非常重要的酶，它能利用分子氧作为电子受体，专一催化β-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸和过氧化氢。由于其与生命重要物质葡萄糖和氧的密切关系，导致了它在科研、医药和食品工业生产上广泛的应用。在食品工业中，葡萄糖氧化酶可用于除去食品或药品中的葡萄糖，从而防止食品发生褐变或获得纯度较高的低聚糖；同时，葡萄糖氧化酶凭其天然的优良特性,可作为一个较为理想的溴酸钾取代物，用作一种更为安全的面粉改良剂；在发酵工业中，葡萄糖氧化酶的催化产物-葡萄糖酸，可用于生产葡萄糖酸钙、葡萄糖酸锌等；在医学诊断方面，鉴于葡萄糖氧化酶作用的高度专一性,也被用于一些复杂生化体系中葡萄糖的定量测定,如快速检测血糖、尿糖。

国家知识产权局于2014年8月6日公布的一篇专利申请号为201410228211.0，名称：葡萄糖氧化酶制剂的制备方法及其利用，此专利提出如下技术方案：将特异青霉接种于含有碳源、氮源、无机盐液及微量元素的发酵培养基的发酵罐进行通气发酵制成发酵液，发酵液经固液分离制成葡萄糖氧化酶制剂，该菌种制备的葡萄糖氧化酶存在如下的技术问题：其一，该菌种发酵培养产生的葡萄糖氧化酶的热稳定性差，并且在酸性环境下很容易失活，不具有耐酸性；其二，该菌种发酵培养产生的葡萄糖氧化酶的酶活力低，且生产效率低下；这俩个问题大大限制了该菌种制备的葡萄糖氧化酶的使用范围，因此，该制备方法制备的葡萄糖氧化酶难以在市场上推广和使用。

目前国内外己有许多葡萄糖氧化酶的相关研究报道，其中大部分来源于微生物，微生物中一般对中温菌的产酶研究较多，而对嗜热真菌产耐热葡萄糖氧化酶的研究相对较少。因此，研究嗜热拟青霉产耐热性的葡萄糖氧化酶具有重大的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种热稳定性高、耐酸性好的且酶活力高的葡萄糖氧化酶酶制剂的发酵制备方法及分离纯化方法，本发明通过分段培养及中间补料技术提高葡萄糖氧化酶的产量，并进一步从发酵液中分离纯化到高纯度的葡萄糖氧化酶。该发酵制备的葡萄糖氧化酶耐热性高、耐酸性好，非常适合在食品及饲料中适用。

为了解决上述技术问题,本发明提供了一种嗜热拟青霉产耐热耐酸的葡萄糖氧化酶的发酵制备方法，具体步骤如下：

(1)将嗜热拟青霉菌种在PDA活化培养基平板上划线活化，并将PDA活化培养基平板置于30～40℃的恒温培养箱中活化培养48～72h，即得嗜热拟青霉丝；

(2)用接种环刮取步骤(1)中所制备的嗜热拟青霉丝接种于斜面培养基上，并将斜面培养基置于30～40℃的条件下培养2～4d，即得孢子；

(3)将步骤(2)中所制备的孢子用含有0.01％(v/v)吐温80的0.75％无菌生理盐水清洗孢子，将清洗后的孢子放入盛有50～55mL无菌生理盐水和无菌玻璃珠的锥形瓶中并充分振荡30～45min，待孢子充分分散后，制备孢子含量为1.0×10⁸CFU/mL的孢子悬液，即得单孢子菌悬液；