[发明专利]一种助表达基因片段及其无细胞表达ADCY2蛋白系统

说明书

本发明公开了一种助表达序列及其无细胞表达ADCY2蛋白系统，属于生物技术领域。该助表达序列的氨基酸序列如序列表SEQ ID1所示。该助表达序列主要应用于多次跨膜蛋白的无细胞表达。本发明的一种助表达序列及其在无细胞表达ADCY2蛋白中的应用方法，能解决无细胞蛋白表达量低的问题。

技术领域

本发明涉及无细胞表达领域，具体涉及一种助表达序列及其无细胞表达ADCY2蛋白系统。

背景技术

结构和功能分析需要大量的膜蛋白样本，但是一个瓶颈是如何大批量高效的获得膜蛋白。在无细胞表达系统生产蛋白复杂性降低带来了转录翻译流程的高效运转。采用助表达序列的策略可以基于翻译起始的优化带来无细胞表达效率的快速提高。高频使用稀有密码子以及不利起始翻译已被确定为蛋白质生物合成的主要限制步骤，在mRNA的5'端区域，如核糖体结合位点涉及高风险的二级结构的形成可以减缓甚至阻止启动程序，高频的稀有密码子可能造成翻译停顿，错配的氨基酸，甚至过早终止事件，但这样的问题可以由合成基因表达的优化来解决。

腺苷酸环化酶，简称ADCY，是膜整合蛋白，12次跨膜糖蛋白，是G蛋白的效应物，能催化ATP生成cAMP，引起细胞应答。腺苷酸环化酶广泛分布于哺乳动物的细胞膜中，此酶催化ATP生成cAMP并释放焦磷酸。腺苷酸环化酶主要分布于细胞质膜、核膜和内质网膜上。腺苷酸环化酶(ADCY)是G蛋白偶联受体(GPCRs)下游的关键信号分子。基本上标准的无细胞是无法表达出完整的蛋白分子的，所以需要对无细胞表达条件进行改进。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供助表达序列及其无细胞表达ADCY2蛋白系统，能解决无细胞蛋白表达量低的问题。

本发明通过以下技术方案实现：一种助表达序列及其无细胞表达ADCY2蛋白系统，所述助表达序列的氨基酸序列如序列表SEQ ID1所示。

作为进一步优选的，所述助表达序列主要应用于多次跨膜蛋白的无细胞表达。

本发明还提供了一种如上述所述的助表达序列的无细胞表达ADCY2蛋白系统，所述表达体系包括如下成分：HEPES-KOH缓冲液、ATP、GTP、UTP、CTP、cAMP、谷氨酸钾、醋酸铵、醋酸镁、亚叶酸、T7 RNA聚合酶、氨基酸、PET8000、磷酸烯醇式丙酮酸、大肠杆菌抽提物；将含助表达序列表达质粒加入无细胞蛋白表达体系中进行表达。

作为进一步优选的，所述表达质粒是由将待表达的ADCY2蛋白基因进行密码子优化后与助表达序列的基因和组氨酸标签进行连接，设计引物并引入双酶切位点，将连接得到的目的片段克隆到含T7启动子的表达载体pET28a上获得；

作为进一步优选的，所述ADCY2基因进行密码子优化后的序列如序列表2所示。

作为进一步优选的，通过SOE-PCR方法以及平端连接方法在ADCY2基因密码子优化后的片段的N端连接助表达序列的基因片段、C端连接组氨酸标签。

本发明的有益效果为：本发明通过在ADCY2基因上添加助表达序列进行无细胞表达，蛋白表达量高，解决了无细胞蛋白表达量低的问题。

附图说明

图1为实施例1的ADCY2无细胞表达后的蛋白纯化电泳图；

图2为对比例1的ADCY2无细胞表达后的蛋白纯化电泳图。

具体实施方式

下面结合附图和实施方式对本发明做进一步的详细说明。以下实施例仅是范例性的，仅用以对本发明的技术方案做更进一步的详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，在不偏离本发明技术方案的精神和范围内，对技术方案进行的修改或者替换均应涵盖在本发明的权利要求保护范围内。