[发明专利]用于血浆ctDNA非特异复制的试剂盒

权利要求书

1.一种用于血浆ctDNA非特异性复制的方法，其使用试剂盒实施，

所述试剂盒包括：

用于加接头的试剂，所述用于加接头的试剂包括接头；

用于PCR扩增的试剂，所述用于PCR扩增的试剂包括3'末端有dU标记的引物和KAPAHiFi Uracil+聚合酶体系；

用于切割的试剂，所述用于切割的试剂包括具有dU切割功能的酶和单链特异性切割功能的酶，

所述3'末端有dU标记的引物为核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的单链DNA与核苷酸序列如SEQ ID NO： 4所示的单链DNA，

SEQ ID NO：3：5'- GCACTAGGCTACACGACGATCTAACTAGCU-3'，

SEQ ID NO：4：5'- CAGTGGTCAGACGTGGAATCTAACTAGCU-3'，

所述方法包括：

步骤A：将血浆ctDNA片段进行加接头，得到加接头DNA片段；

步骤B：使用在3'末端有dU标记的引物对所述加接头的DNA片段进行PCR扩增，得到带有dU标记的PCR产物；

步骤C：使用具有dU切割功能的酶切除PCR产物中的dU，得到具有缺刻的DNA片段；以及

步骤D：使用具有单链特异性切割功能的酶酶切具有缺刻的DNA片段，得到与血浆ctDNA片段基本相同的可利用DNA片段。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述接头为核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的单链DNA与核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的单链DNA的退火产物，

SEQ ID NO：1：5'- GCTAGTTAGATCGTCGTGTAGCCTAGTGC-3'，

SEQ ID NO：2：5'- CAGTGGTCAGACGTGGAATCTAACTAGCT-3'。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述用于加接头的试剂还包括选自下组中的至少一种：T4 DNA连接酶和T4 DNA连接酶缓冲液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述具有dU切割功能的酶为EndonucleaseⅧ和UDG混合物。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述具有单链特异性切割功能的酶为绿豆核酸酶和/或S1核酸酶。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶切的试剂还包括选自下组中的至少一种： Endonuclease Ⅷ缓冲液及UDG缓冲液、绿豆核酸酶缓冲液以及SI核酸酶缓冲液。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述试剂盒还包括：用于末端修复的试剂和/或用于3'端加A的试剂，

所述用于末端修饰的试剂包括选自下组中的至少一种或两种以上： T4 DNA 聚合酶、T4 多聚核苷酸激酶、Klenow 片段、Klenow缓冲液以及T4 多聚核苷酸激酶缓冲液；

所述用于3'端加A的试剂包括选自下组中的至少一种：Klenow片段（3'-5'exo-）和Klenow缓冲液。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将步骤A中的血浆ctDNA片段先进行末端修复和/或3'端加A，再进行加接头。