[发明专利]用于血浆ctDNA非特异复制的试剂盒

说明书

本发明涉及一种用于血浆ctDNA非特异性复制的试剂盒。本发明的试剂盒包括用于加接头的试剂、用于PCR扩增的试剂、用于切割的试剂。应用本发明的试剂盒进行血浆ctDNA复制具有以下优点：获得大量与血浆ctDNA基本相同的可利用DNA片段。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种用于血浆ctDNA非特异性复制的试剂盒。

背景技术

肿瘤细胞会向血液中释放基因组DNA，这些变异DNA也随之释放到外周血中，被称为循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)。研究发现，ctDNA在早期原位癌(primarycancer)患者血液中就已经开始出现。由于外周血循环DNA半衰期短，因此循环肿瘤DNA能够真实反映患者病变组织基因突变的真实情况。另有文献报道，癌变人群血浆中游离100～400bp大小的DNA片段浓度明显高于正常人，可以作为筛查的标志物。

但其含量极少，在提取过程中容易丢失，提取难度大，提取量较少，难以满足常规检测或研究的要求，如何获得足量的ctDNA片段，是针对此类DNA进行研究及检测急需解决的问题。

发明内容

鉴于上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种用于血浆ctDNA非特异复制的试剂盒，用于可以对血浆中的ctDNA进行有效复制，可获得大量与游离ctDNA序列基本相同DNA片段。

本发明为解决上述问题进行了深入研究，结果发现：使用具有dU标记的引物对加接头的DNA片段进行PCR扩增，使用具有dU碱基切割功能的酶及具有单链特异性切割功能的酶对PCR扩增产物进行酶切，可完全切除接头序列，获得大量与与进行血浆ctDNA片段基本相同的DNA片段。

即，本发明包括：

1.一种用于血浆ctDNA非特异性复制的试剂盒，其中，包括：

用于加接头的试剂，所述用于加接头的试剂包括接头；

用于PCR扩增的试剂，所述用于PCR扩增的试剂包括3'端有dU标记的引物；

用于切割的试剂，所述用于切割的试剂包括具有dU切割功能的酶和单链特异性切割功能的酶。

2.根据项1所述的试剂盒，其中，所述接头为核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的单链DNA与核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的单链DNA的退火产物，

SEQ ID NO：1：5'-GCTAGTTAGATCGTCGTGTAGCCTAGTGC-3'，

SEQ ID NO：2：5'-CAGTGGTCAGACGTGGAATCTAACTAGCT-3'。

3.根据项1～2任一项所述的试剂盒，其中，所述3'端dU标记的引物为核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的单链DNA与核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的单链DNA，

SEQ ID NO：3：5'-GCACTAGGCTACACGACGATCTAACTAGCU-3'，

SEQ ID NO：4：5'-CAGTGGTCAGACGTGGAATCTAACTAGCU-3'。

4.根据项1～3任一项所述的试剂盒，其中，所述用于加接头的试剂还包括选自下组中的至少一种：T4DNA连接酶和T4DNA连接酶缓冲液。

5.根据项1～4任一项所述的试剂盒，其中，所述具有dU切割功能的酶为EndonucleaseⅧ和UDG的混合物。

6.根据项1～5任一项所述的试剂盒，其中，所述具有单链特异性切割功能的酶为绿豆核酸酶和/或S1核酸酶。