[发明专利]一种从多种混合DNA中超灵敏检测痕量DNA的方法和试剂

说明书

本发明公开了一种从多种混合DNA中超灵敏检测痕量DNA的方法和试剂，所述方法包括：(a)使用探针对含有待检测位点或待检测区域的目标DNA的接头连接产物进行探针预富集，其中所述探针是双链寡核苷酸，所述接头连接产物的两端的接头均包括通用引物的结合位点；(b)使用针对所述待检测位点或待检测区域的上游特异性引物和下游特异性引物，以及两端的通用引物对探针预富集产物进行特异性富集，再对特异性富集产物进行通用引物扩增。本方法解决了现有检测技术针对含有大量外源DNA污染的复杂样本检测灵敏度低的技术问题。

技术领域

本发明涉及DNA检测技术领域，尤其涉及一种从多种混合DNA中超灵敏检测痕量DNA的方法和试剂。

背景技术

在科研、临床或健康体检等领域中进行基因检测时经常需要进行非伤害性取样，即通过获取人的毛发、指甲、粪便(含有肠道脱落细胞)、尿液、唾液、食物残渣(含有口腔脱落细胞)、呕吐物(含有消化道脱落细胞)、霉变生菌的组织或体液等复杂样本中对某一物种(通常是人)的特定DNA区域进行检测；在法医、刑侦等领域也时有发生样本保存不善或特定环境下取样的情况。这些样本成分往往及其复杂。从这些样本中提取的DNA往往含有大量的非目标物种DNA。例如，从粪便样本中提取的DNA是很多种DNA的混合物。其中大约60％的DNA来源于肠道细菌，剩余的绝大部分DNA来源于动物或植物食物残渣，可用于检测的结肠黏膜脱落细胞的DNA占总DNA的千分之一甚至更少。目前实验室常用的DNA检测方案如QPCR、时间飞行质谱、一代测序、高通量测序等都基于PCR(聚合酶链式反应)技术。而在大量的非目标物种DNA干扰存在的情况下，基于引物结合模板并延伸的PCR技术特异性会很差。从而导致以上常用的DNA检测方案会受到不同程度的影响。尤其在使用高通量测序技术对掺有大量混合物种DNA的痕量目标DNA进行目标区域测序时，需要投入大量的DNA样本，以保证痕量目标DNA有足够的拷贝数以对其准确检测。这时无用的其它物种DNA也越多，干扰作用也就越强。因此如何有效去除大量的非目标物种DNA的干扰并进行灵敏准确的特定DNA目标区域富集检测成为科研技术人员要解决的技术难题。

目前现有的技术解决方案为在DNA抽提的过程中针对细菌等原核细胞和真核细胞的特性不同进行一定程度的区分。细菌等原核细胞较真核细胞不容易裂解，所以在抽提DNA时不进行加热裂解，而采用比较温和的裂解方案就可以减少总DNA中细菌DNA的含量。但实际自然环境下细菌自身就会裂解死亡并释放DNA，并且这种技术方案针对其它真核细胞DNA没有筛选去除作用，所以该方案效果往往不是很好。

发明内容

本发明提供一种从多种混合DNA中超灵敏检测痕量DNA的方法和试剂，解决了现有检测技术针对含有大量外源DNA污染的复杂样本检测灵敏度低的技术问题。

根据本发明的第一方面，本发明提供一种从多种混合DNA中超灵敏检测痕量DNA的方法，包括：

(a)使用探针对含有待检测位点或待检测区域的目标DNA的接头连接产物进行探针预富集，其中上述探针是双链寡核苷酸，上述接头连接产物的两端的接头均包括通用引物的结合位点；

(b)使用针对上述待检测位点或待检测区域的上游特异性引物和下游特异性引物，以及两端的通用引物对探针预富集产物进行特异性富集，再对特异性富集产物进行通用引物扩增。

进一步地，上述探针是通过PCR扩增得到的一对或多对覆盖待检测位点或待检测区域的双链寡核苷酸。

进一步地，上述探针带有亲和标记；优选地，上述亲和标记是位于上述探针两条链的5’端的生物素标记。

进一步地，上述步骤(b)使用多条上述上游特异性引物组成的引物组和多条上述下游特异性引物组成的引物组。

进一步地，上述探针长度为150-200bp。

进一步地，每一个上述上游特异性引物和下游特异性引物距离上述待检测位点或待检测区域的距离为1-20个碱基，优选1-5个碱基。