[发明专利]一种检测聚乙二醇修饰蛋白质药物纯度的方法

说明书

本发明涉及一种检测聚乙二醇化蛋白质纯度的方法，该方法以疏水层析法(HIC)检测，该方法选用PEG作为流动相添加剂，所述PEG修饰剂的分子量不小于制备所述聚乙二醇修饰蛋白时所采用的PEG修饰剂。本发明方法建立了疏水层析法(HIC)法用于聚乙二醇化蛋白质的纯度检测方法，解决了现有疏水层析法(HIC)法无法或难以用于聚乙二醇化蛋白质纯度检测的问题，完善了聚乙二醇化蛋白质的纯度分析方法，更好地控制药品质量。

技术领域

本发明涉及一种适用于聚乙二醇化蛋白质的纯度检测方法，尤其是适用于聚乙二醇化药用蛋白酶的纯度检测，更具体的是一种聚乙二醇化门冬酰胺酶、激肽原酶或精氨酸脱亚胺酶的纯度检测方法。

背景技术

药用蛋白和多肽普遍存在生物稳定性差、体内半衰期短和具有免疫原性等缺点，通常采用基因工程改造和化学修饰等手段对其进行改造修饰以克服上述缺点。聚乙二醇(PEG)是一种线性、在溶液中可自由卷曲的不带电荷的聚合物，具有无毒、微弱的抗原性和良好的生物相容性。用它来共价修饰蛋白质，可以增加蛋白质的体内循环半衰期和减小其抗原性，增加蛋白质的溶解性并会改变蛋白质在人体内的生物学分布。自1977年Abuchowski，Davis(J.Biol.Chem.1977,252:3578-3581.)等人首次报道用PEG修饰蛋白质以来，PEG已经被广泛地应用于蛋白多肽类药物的修饰研究，蛋白质PEG化技术已经成为降低蛋白质生物药物的免疫原性、改善其药代动力学/药效学性质最有效的方法之一。

采用常规的SDS-PAGE方法来分析聚乙二醇化蛋白质的纯度(中国药典2005年版二部附录V F第五法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法)存在诸多问题：1.操作繁琐，耗时较长。总体说来，SDS-PAGE需要经历制板-制分离胶-制浓缩胶-电泳槽安装-制样-加样-电泳-剥胶-染色-脱色-结果观察等十一个步骤；尽管可以购买商品化的电泳胶节省制胶的步骤和时间，但是依旧耗时较长，第一，样品的制备需要放入100℃加热5-10min；第二，电泳需要45min～1hr；第三，考马斯亮蓝染色、脱色同样需要1～2hr，并且需要多次更换脱色液。2.方法精密度较差，且具有一定的危险性。首先，若使用的是商品胶，方法的精密度取决于商品胶的生产质量；若为自制胶，则凝胶聚合受各种因素的影响，丙烯酰胺有毒性，能致癌致突变；TEMED易燃易挥发，有强神经毒性。3.方法灵敏度低，主成分与杂质分离度无法达到要求。聚乙二醇化蛋白质一般是蛋白质与一个以上的聚乙二醇通过共价结合而制得的。每一个蛋白质分子上都结合有一定数量的聚乙二醇。被聚乙二醇修饰后蛋白质受长链PEG水力学臂的影响，在电泳胶上呈弥散状态分别，根本无法准确考察聚乙二醇化蛋白质所产生的微量降解或聚集杂质。4.方法难以定量，目前除了灰度扫描外，并没有有效的手段通过SDS-PAGE电泳胶对目的蛋白进行定量分析；而灰度扫描也是通过色阶的差异进行分析，缺乏准确性及稳定性。

另一方面，疏水层析(HIC)是利用蛋白质在高盐浓度时与固相载体上的疏水配基结合，在洗脱时将盐浓度逐渐降低，因其疏水性不同而逐个洗脱、分离。发明人在开发聚乙二醇修饰蛋白纯度检测方法时即参考了原蛋白的纯度检测方法——HIC方法，但并不能有效检测。HIC方法经常用于蛋白的分离与纯化，分析型HIC不常用，故可以参考的文献资料有限。本发明旨在开发适用于聚乙二醇修饰蛋白纯度检测的疏水作用色谱(HIC)方法。

发明内容

本发明解决的技术问题是：现有聚乙二醇化蛋白质纯度分析方法操作繁琐、精密度差、灵敏度低并具有一定的安全隐患；以及常规疏水层析法无法检测或出峰拖尾严重等的问题。

本发明旨在开发适用于聚乙二醇修饰蛋白纯度检测的HIC方法，选用PEG作为流动相添加剂，所述PEG修饰剂的分子量不小于制备所述聚乙二醇修饰蛋白时所采用的PEG修饰剂。

优选地，流动相添加剂还含有异丙醇。

更优选地，所述流动相中含有0.02％～2％(V/V)的PEG修饰剂。