[发明专利]一种克罗诺阪崎肠杆菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒。包括：捕获探针、检测引物T7引物和nT7引物、检测探针、M‑MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶等试剂。本发明试剂盒能够检食品中的阪崎肠杆菌的RNA，具有特异性高、灵敏度高(可达1000CFU/ml)、污染低(扩增产物RNA在自然环境下易于降解)及快速检测(常规60分钟完成检测)的特点，将在食品安全中发挥重要作用，应用前景广阔。

技术领域

本发明涉及病原微生物的生物检测技术领域，具体涉及一种利用磁珠-RNA富集技术提取纯化靶标RNA及实时荧光核酸恒温扩增检测技术对克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacterspp)进行检测的试剂盒。通过本发明的试剂盒可实现对食品中的克罗诺阪崎肠杆菌的检测。

背景技术

阪崎肠杆菌(克罗诺杆菌属)(Cronobacter spp)是一种食源性条件致病菌，可以引起新生儿严重的脑膜炎，坏死性小肠结肠炎和菌血症等疾病，在新生儿中有较高的致死率。近年来对食品、饮料、加工原料、环境等阪崎肠杆菌污染率的研究发现，阪崎肠杆菌在自然界中分布广泛。

目前对阪崎肠杆菌(克罗诺杆菌属)检测常用的有培养法和分子生物学方法。分子生物学法主要有普通PCR、实时荧光定量PCR、环介导恒温扩增和探针方法等。分子生物学克服了培养法实验操作繁琐，耗时长等，但是一般PCR法需要经历几十个温度变化的循环过程，扩增反应时间长，且产物为DNA，易污染。因此，开发一种快速、灵敏、特异且不易污染的试剂盒非常必要。

实时荧光核酸恒温扩增检测技术(Simultaneous Amplification and Testing，简称SAT)是一种直接快速检测RNA的方法，与检测DNA的实时荧光PCR相比，不同之处，前者检测体系多了一个逆转录反应的步骤，核酸扩增在一个温度下进行(42℃)，无需热循环。采用M-MLV逆转录酶和T7 RNA聚合酶进行核酸扩增，相对于其它核酸扩增技术，反应抑制物更少，能有效减少假阴性结果。然而，SAT技术在不同种类细菌的检测中应用所面临的问题各不相同，需要具体分析细菌的特性进行专门设计。目前尚无针对克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)的实时荧光核酸恒温扩增检测技术的研究报道。

发明内容

为解决现有的克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)检测方法灵敏度较低，检测周期长、易引起扩增物的污染造成实验结果的假阳性或假阴性以及检测成本较高的问题，本发明提供了一种检测周期短、高灵敏度、高特异性、低污染、反应稳定以及检测成本低、易于推广应用的克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)实时荧光核酸恒温扩增检测技术，包括专用引物、探针、试剂盒及其使用。

本发明所提供的克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacter spp)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，包含有一条可与如序列表中序列1所示的克罗诺阪崎肠杆菌(Cronobacterspp)的靶标核酸(16sRNA)序列特异结合的捕获探针，一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生靶标核酸(16sRNA)的DNA拷贝的扩增引物T7和nT7，和一条用于与在T7 RNA聚合酶作用下根据所述靶标核酸(16sRNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的检测探针。

所述捕获探针可与如序列表中序列1所示的克罗诺阪崎肠杆菌Cronobacter spp)的靶标核酸(RNA)序列特异结合，在有内标(IC RNA)时，其最好还可与该内标序列特异结合，所述捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述扩增引物由T7引物和nT7引物组成，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；所述检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。

进一步，所述试剂盒还包含有M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶，所述M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶存在于SAT酶液中，所述捕获探针存在于核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和检测探针存在于检测液中。