[发明专利]反式-L-脯氨酸-4-羟化酶基因、酶、载体、工程菌及应用

权利要求书

1.一种反式-L-脯氨酸-4-羟化酶基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.一种含权利要求1所述反式-L-脯氨酸-4-羟化酶基因的重组载体。

3.一种由权利要求2所述重组载体构建的重组基因工程菌。

4.一种权利要求1所述反式-L-脯氨酸-4-羟化酶基因在制备反式-4-羟基-L-脯氨酸酶中的应用，其特征在于所述的应用为：构建含有所述反式-L-脯氨酸-4-羟化酶基因的重组载体，将所述重组载体转化到大肠杆菌感受态细胞中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，取培养液分离得到含有反式-L-脯氨酸-4-羟化酶基因的菌体细胞。

5.一种权利要求1所述反式-L-脯氨酸-4-羟化酶基因在催化L-脯氨酸制备反式-4-羟基-L-脯氨酸中的应用，其特征在于所述的应用为：以含有反式-L-脯氨酸-4-羟化酶基因的重组工程菌经诱导培养获得的湿菌体为酶源，以L-脯氨酸为底物，以FeSO₄和α-酮戊二酸为辅底物、以L-抗坏血酸为抗氧化剂、以pH5.0-7.0、60-240 mM的MES缓冲液为反应介质构成反应体系，在20~40℃、150rpm条件下反应，反应完全后，将反应液分离纯化，得到产物反式-4-羟基-L-脯氨酸。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述反应体系中，湿菌体的质量用量为20 g/L，底物初始浓度为0.5-2.0g/L，FeSO₄终浓度为0.1-2.0mM，α-酮戊二酸终浓度为2.0-12.0mM，L-抗坏血酸终浓度为2.0-10.0 mM。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述反应体系中添加有表面活性剂Nymeen-S215；所述表面活性剂Nymeen-S215的体积用量以反应体系体积计为0.5-1.5%。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述反应体系中还添加有葡萄糖，所述葡萄糖终浓度以反应体系体积计为2-10 g/L。

9.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述酶源制备步骤如下：将含有反式-L-脯氨酸-4-羟化酶基因的重组工程菌接种到含终浓度40μg/mL卡那霉素的LB液体培养基种，37°C、150rpm培养至OD₆₀₀=0.8-1.0，获得种子液；将种子液以体积浓度2%的接种量转入含终浓度40 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37°C、150rpm条件下培养OD₆₀₀=0.4-0.8，向培养液中添加终浓度0.5 mM的IPTG，28°C、150rpm诱导培养10h，获得诱导培养液，将诱导培养液离心，pH 6.5、80 mM的MES缓冲液洗两次后收集湿菌体，即为酶源；所述LB液体培养基组成：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L， NaCl10g/L，溶剂为水，pH值为7.0。