[发明专利]反式-L-脯氨酸-4-羟化酶基因、酶、载体、工程菌及应用有效

专利信息
申请号: 201611269776.9 申请日: 2016-12-31
公开(公告)号: CN106591330B 公开(公告)日: 2019-06-14
发明(设计)人: 郑裕国;周海岩;王培;李会帅;柳志强 申请(专利权)人: 浙江工业大学
主分类号: C12N15/53 分类号: C12N15/53;C12N9/02;C12N1/21;C12P13/24;C12R1/19
代理公司: 杭州天正专利事务所有限公司 33201 代理人: 黄美娟;李世玉
地址: 310014 浙*** 国省代码: 浙江;33
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摘要:
搜索关键词: 脯氨酸 反式 葡萄糖 羟化酶基因 工程菌 酶活 羟基 表面活性剂 菌体细胞 生物转化 产物量 湿细胞 羟化酶 酶源 催化 应用 合成
【说明书】:

发明公开了一种反式‑L‑脯氨酸‑4‑羟化酶基因、酶、载体、工程菌以及在催化L‑脯氨酸合成反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸中的应用。所述反式‑L‑脯氨酸‑4‑羟化酶的酶活达到1654.08U/L,比酶活为82.74U/mg湿细胞;直接收集含酶的菌体细胞作为酶源进行生物转化,反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸的量为24.8mg/L;向反应体系中添加0.8%表面活性剂Nymeen‑S215后产量高达176.0mg/L,比同条件下不添加Nymeen‑S215时提高了6.36倍;在此基础上向反应体系中添加5g/L葡萄糖,产物量为329.2mg/L,是不添加葡萄糖时的1.87倍。

(一)技术领域

本发明涉及一种产反式-L-脯氨酸-4-羟化酶(trans-L-Proline-4-hydroxylase,简称trans-P4H)的基因工程菌及其构建方法和应用,属于基因工程领域。

(二)技术背景

反式-L-脯氨酸-4-羟化酶(trans-L-Proline-4-hydroxylase,简称trans-P4H)是依赖α-酮戊二酸和Fe2+的双加氧酶超家族成员之一,可以作为生物催化剂在反式-4-羟基-L-脯氨酸(trans-4-hydroxy-L-proline,简称t-4Hyp)的生物法合成中发挥关键作用。trans-P4H在辅助因子α-酮戊二酸(α-KG)、Fe2+和O2存在的条件下(有时还需要以L-抗坏血酸为还原剂)可将游离的L-脯氨酸转化为t-4Hyp。

t-4Hyp是一种重要的非天然氨基酸,是L-羟脯氨酸的同分异构体,其结构中含有一个四氢吡咯环和一个羧基,在生物体中的一些生理和病理过程中扮演着重要的角色,其应用价值和潜力也颇受关注。t-4Hyp拥有巨大的市场前景,在食品、化妆品、医药和化工等多个行业发挥着重要的作用,市场需求呈现逐年递增的趋势,目前国内市场售价高达60多万元/吨。开发t-4Hyp高效、低成本生产技术,是目前t-4Hyp生产和开发领域的一个研究热点。

据报道,生物体内没有携带L-羟脯氨酸的tRNA。肽链中的L-羟脯氨酸是L-脯氨酸在特定羟化酶(对游离的L-Pro不起作用)的作用下羟化而来的。对富含L-羟脯氨酸的动物胶原蛋白进行酸水解,是目前制备t-4Hyp的主要方法。该方法的得率仅为4%-7%,且工艺安全性较差,对设备要求高,并会对环境造成严重污染。同时,动物疾病(疯牛病、口蹄疫等)的爆发严重限制了胶原蛋白的来源,使得该方法已不能满足市场需求。化学合成法路线长(保护/去保护)、环境污染严重、成本高,不适合工业化生产。而以trans-P4H为催化剂,以游离的L-Pro为底物,以α-KG、Fe2+和O2为辅助因子,抗坏血酸为还原剂的生物法生产具有污染小、成本低、效率高、产物光学纯度高的优势,因此t-4Hyp的生物法生产和技术开发受到越来越多的关注。

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