[发明专利]一种用于快速判断小分子结合人体肝脏果糖1;6-二磷酸酶底物位点或变构位点的方法

权利要求书

1.一种用于快速判断小分子结合人体肝脏果糖1,6-二磷酸酶底物位点或变构位点的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)采用氨基酸定点突变技术将果糖1,6-二磷酸酶的蛋白序列262位(底物位点)的苯丙氨酸突变为色氨酸，记为蛋白F262W；同理，采用氨基酸定点突变技术将果糖1,6-二磷酸酶的蛋白序列89位(变构位点)的苯丙氨酸突变为色氨酸，记为蛋白F89W；

(2)将小分子与蛋白F262W结合，在不同温度下，利用荧光分光光度计检测小分子和蛋白F262W结合时的荧光猝灭过程，经数据处理后得到不同温度下小分子和蛋白F262W结合时的荧光猝灭常数，记为K_SV；同理，将小分子与蛋白F89W结合，在不同温度下，利用荧光分光光度计检测小分子和蛋白F89W结合时的荧光猝灭过程，经数据处理后得到不同温度下小分子与蛋白F89W结合时的荧光猝灭常数，记为K’_SV；

(3)利用荧光猝灭常数K_SV和K’_SV进行结果判定：

a.若蛋白F262W荧光猝灭且Ksv随着温度的升高而降低，则表明小分子结合在果糖1,6-二磷酸酶的底物位点上；反之，若蛋白F262W未荧光猝灭或Ksv随着温度的升高而升高，则表明小分子未结合在果糖1,6-二磷酸酶的底物位点上；

b.若蛋白F89W荧光猝灭且K’_SV随着温度的升高而降低，则表明小分子结合在果糖1,6-二磷酸酶的变构位点上；反之，若蛋白F89W未荧光猝灭或K’_SV随着温度的升高而升高，则表明小分子未结合在果糖1,6-二磷酸酶的变构位点上。

2.根据权利要求1所述用于快速判断小分子结合人体肝脏果糖1,6-二磷酸酶底物位点或变构位点的方法，其特征在于，所述荧光分光光度计检测荧光猝灭过程的测试体系为：0.8mM Mg²⁺，50mM Tris-HCl，0.15mg/mL蛋白F262W或蛋白F89W，pH 7.4，体系总体积为1mL。

3.根据权利要求1所述用于快速判断小分子结合人体肝脏果糖1,6-二磷酸酶底物位点或变构位点的方法，其特征在于，所述荧光分光光度计的设置为激发波长为280nM，发射波长设为285～400nM，狭缝长度为5nm，平滑因子为7，电压为710V。

4.根据权利要求1所述用于快速判断小分子结合人体肝脏果糖1,6-二磷酸酶底物位点或变构位点的方法，其特征在于，利用Stern-Vlomer方程对数据进行处理得到荧光猝灭常数，所述Stern-Vlomer方程为其中F₀为不加小分子时波峰最高点的荧光强度，F为加入小分子后波峰最高点的荧光强度，Q为小分子浓度。

5.根据权利要求1所述用于快速判断小分子结合人体肝脏果糖1,6-二磷酸酶底物位点或变构位点的方法，其特征在于，检测301K～310K温度下的荧光猝灭常数用于判定荧光猝灭常数随温度的变化情况。