[发明专利]一种用于快速判断小分子结合人体肝脏果糖1;6-二磷酸酶底物位点或变构位点的方法

说明书

本发明属于小分子结合酶位点技术领域，具体涉及了一种用于快速判断小分子结合人体肝脏果糖1,6‑二磷酸酶底物位点或变构位点的方法。本发明采用氨基酸定点突变技术将果糖1,6‑二磷酸酶的蛋白序列262位(底物位点)的苯丙氨酸突变为色氨酸，记为蛋白F262W；将果糖1,6‑二磷酸酶的蛋白序列89位(变构位点)的苯丙氨酸突变为色氨酸，记为蛋白F89W；利用小分子与蛋白F262W或蛋白F89W结合，引起蛋白周围环境发生变化，使得荧光发生猝灭，通过判断荧光猝灭的情况实现快速简便的判断小分子是否与果糖1,6‑二磷酸酶的底物位点或变构位点结合，本发明方法具有特异性好，灵敏度高的优点。

技术领域

本发明属于小分子结合酶位点技术领域，具体涉及了一种用于快速判断小分子结合人体肝脏果糖1,6-二磷酸酶底物位点或变构位点的方法。

背景技术

二型糖尿病正在成为世界范围性的疾病，预计到2030年，全球将有3.66亿人得糖尿病。糖尿病患者长期存在的高血糖，会损害人体内的各种器官组织，例如眼睛、肾、神经、心脏、还有血管。糖尿病的发病机理主要为胰岛素分泌不足，胰岛素抵抗和肝葡萄糖生成增加。此外，内源性的葡萄糖生成增加是造成糖尿病患者空腹血糖升高的主要原因。内源性的葡萄糖主要来源于肝脏。肝脏内葡萄糖代谢主要为两个途径，一个是糖异生过程，另一个是肝糖原分解。因此通过调节糖异生途径，减少肝脏葡萄糖的生成，成为开发新作用机制抗糖尿病药物的新策略。

糖异生作用是将乳酸，丙三醇等三碳前体，在多种酶的催化下转化为葡萄糖的过程。在糖异生过程中，果糖1,6-二磷酸酶(FBPase)催化果糖1,6-二磷酸生成果糖-6-磷酸和一分子磷酸。该催化反应是糖异生过程中的一个控速步骤，抑制果糖1,6-二磷酸酶(FBPase)的活性，可以减少肝脏葡萄糖的生成，降低血糖水平，达到治疗糖尿病的目的。

果糖1,6-二磷酸酶(FBPase)是一个同源四聚体，由四个结构相同的单位组成。每个单体结构中含有两个结合位点：底物位点和AMP变构位点。目前已经报道了许多化合物对果糖1,6-二磷酸酶(FBPase)有抑制作用。而清楚明确的知晓小分子和果糖1,6-二磷酸酶(FBPase)的结合位点对于小分子的设计改造至关重要。而目前判断小分子和果糖1,6-二磷酸酶(FBPase)结合位点主要有：1.X-Ray晶体体衍射法；2.表面等离子共振；3.同位素标记法。但是这些方法实际操作起来却常常存在较大难度。因此，寻找一种快速简便判断小分子的在果糖1,6-二磷酸酶(FBPase)结合位点的方法是急需解决的问题。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的不足，目的在于提供一种用于快速判断小分子结合人体肝脏果糖1,6-二磷酸酶底物位点或变构位点的方法。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：

一种用于快速判断小分子结合人体肝脏果糖1,6-二磷酸酶底物位点或变构位点的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)采用氨基酸定点突变技术将果糖1,6-二磷酸酶的蛋白序列262位(底物位点)的苯丙氨酸(Phe)突变为色氨酸(Trp)，记为蛋白F262W；同理，采用氨基酸定点突变技术将果糖1,6-二磷酸酶的蛋白序列89位(变构位点)的苯丙氨酸(Phe)突变为色氨酸(Trp)，记为蛋白F89W；(2)将小分子与蛋白F262W结合，在不同温度下，利用荧光分光光度计检测小分子和蛋白F262W结合时的荧光猝灭过程，经数据处理后得到不同温度下小分子和蛋白F262W结合时的荧光猝灭常数，记为K_SV；同理，将小分子与蛋白F89W结合，在不同温度下，利用荧光分光光度计检测小分子和蛋白F89W结合时的荧光猝灭过程，经数据处理后得到不同温度下小分子与蛋白F89W结合时的荧光猝灭常数，记为K’_SV；

(3)利用荧光猝灭常数K_SV和K’_SV进行结果判定：