[发明专利]亲水性纳米复合材料结合质谱分析鉴定糖基化肽段的方法

权利要求书

1.一种亲水性纳米复合材料结合质谱分析鉴定糖基化肽段的方法，其特征在于，具体步骤如下：

（一）将亲水性纳米复合材料配制成为0.5-10mg/mL的分散液，溶剂为超纯水，将该分散液与糖基化肽段溶液加入到上样缓冲液中混合，在酶解仪中孵育15-60分钟；该上样缓冲液由超纯水配制，在100 ml上样缓冲液中有75ml~90ml乙腈、0.05ml~1ml甲酸与79mg~197.5mg碳酸氢铵；

（二）在外磁场作用下通过磁性分离纳米复合材料，用缓冲液洗涤，该缓冲洗涤液用超纯水配制，100ml缓冲洗涤液中含有75ml~90ml乙腈、0.05ml~1ml甲酸与79mg~197.5mg碳酸氢铵；随后用混合液洗脱，该混合洗脱液用超纯水配制，100ml混合洗脱液中含有30ml~55ml乙腈、0.05ml~1ml甲酸缓冲液与79mg~197.5mg碳酸氢铵；

（三）取1-3μL洗脱液直接在MALDI-TOF MS的进样靶板上点靶，干燥后再点加1-2μL浓度为15-25mg/mL的2，5-二羟基苯甲酸溶液，形成基质结晶，进行质谱分析；

其中，所述的纳米复合材料为磁性石墨烯表面包覆聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和纳米金颗粒并修饰葡萄糖的亲水性纳米复合材料。

2.根据权利要求1所述的亲水性纳米复合材料结合质谱分析鉴定糖基化肽段的方法，其特征在于，所述的亲水性纳米复合材料具体制备步骤如下：

（1）用浓硝酸对石墨烯进行酸化，在55-65℃条件下反应6-8小时得到酸化石墨烯，随后用去离子水充分洗涤酸化石墨烯，到洗涤液呈中性为止，在40-60℃下真空干燥；

（2）步骤（1）所得的酸化石墨烯加入乙二醇中，加入六水合三氯化铁，超声分散0.5-1.5小时，再加入柠檬酸三钠，乙酸钠和聚乙二醇，室温下搅拌0.5-1小时后把混合物转移至聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中，190-210℃条件下反应8-16小时，制得磁性石墨烯，在外磁场作用下将产物从反应溶液中磁性分离，用去离子水和无水乙醇充分洗涤，在40-60℃下真空干燥；

（3）配制氯金酸水溶液，磁力搅拌并加热至沸腾，再向其中加入柠檬酸三钠水溶液，继续搅拌保持沸腾10-30分钟，然后自然冷却至室温，得到纳米金的水溶胶；

（4）配制含有三羟甲基氨基甲烷和氯化钠的溶液，再加入聚（二烯丙基二甲基氯化铵）溶液形成混合液，向混合液中加入步骤（2）所得的磁性石墨烯，超声分散，再机械搅拌30-45分钟，在外磁场作用下磁性分离并用去离子水充分洗涤；向洗涤后的反应物中加入步骤（3）所得纳米金的水溶胶，室温下机械搅拌1-4小时，得到纳米金颗粒修饰的聚（二烯丙基二甲基氯化铵）包覆的磁性石墨烯，在外磁场作用下将产物从反应溶液中磁性分离，用去离子水充分洗涤，在40-60℃下真空干燥；

（5）配制磷酸盐缓冲液，加入2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐和氨基葡萄糖盐酸盐，在酶解仪上37-60℃反应30-60分钟，向其中加入步骤（4）所得产物纳米金颗粒修饰的聚（二烯丙基二甲基氯化铵）包覆的磁性石墨烯，50-70℃反应1-3小时，在外磁场作用下将产物从反应溶液中磁性分离，用去离子水充分洗涤，在40-60℃下真空干燥，得到磁性石墨烯表面包覆聚（二烯丙基二甲基氯化铵）和纳米金颗粒并修饰葡萄糖的亲水性复合纳米材料；

步骤（1）中石墨烯和浓硝酸的比为（0.3-2）g：（30-130）mL；

步骤（2）中酸化石墨烯、乙二醇、六水合三氯化铁、柠檬酸三钠、乙酸钠和聚乙二醇的比为（50-500）mg：（15-150）mL：（130-1000）mg：（50-500）mg：（600-6000）mg：（300-3300）mg；

步骤（3）中氯金酸、水和柠檬酸三钠的比为（2-10）mg：（20-100）mL：（4-20）mg；

步骤（4）中三羟甲基氨基甲烷，氯化钠和聚（二烯丙基二甲基氯化铵）的浓度比为（0.01-0.05）mol/L：（0.01-0.05）mol/L：（0.1-0.5）% ；

步骤（4）中磁性石墨烯和纳米金水溶胶的比为（5-50）mg：（15-250）mL；

步骤（5）中磷酸盐缓冲液的pH值为7.2-7.4；

步骤（5）中2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐和氨基葡萄糖盐酸盐的质量比为（4.8-5.2）：（2.7-3.2）；

步骤（5）中氨基葡萄糖盐酸盐和步骤（4）所得产物纳米金颗粒修饰的聚（二烯丙基二甲基氯化铵）包覆的磁性石墨烯的质量比为（0.7-1.2）：（0.9-1.4）。