[发明专利]亲水性纳米复合材料结合质谱分析鉴定糖基化肽段的方法

说明书

本发明属于纳米技术领域，具体为一种亲水性纳米复合材料结合质谱分析鉴定糖基化肽段的方法。本发明将纳米复合材料配制成为分散液，溶剂为超纯水，将该分散液与糖基化肽段溶液在80%乙腈/0.1%甲酸缓冲液中混合，在酶解仪中孵育；在外磁场作用下通过磁性分离纳米复合材料，用80%乙腈/0.1%甲酸缓冲液洗涤；再用50%乙腈/0.1%甲酸缓冲液洗脱材料上富集的糖基化肽段，结合质谱分析鉴定。该亲水性纳米复合材料为磁性石墨烯表面包覆聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和纳米金颗粒并修饰葡萄糖的纳米复合材料。本方法操作简单，成本低廉，灵敏迅速，具有较高灵敏度和较好选择性，十分适用于复杂生物样品中的糖基化肽段的检测。

技术领域

本发明属于纳米技术领域，具体涉及一种亲水性纳米复合材料结合质谱分析鉴定糖基化肽段的方法，特别是涉及一种磁性石墨烯表面包覆聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和纳米金颗粒并修饰葡萄糖的复合纳米材料结合质谱技术用于糖基化肽段富集与检测的方法。

背景技术

蛋白质糖基化是生命过程中最重要的翻译后修饰手段之一，在分子识别、细胞内及细胞间信号传导、免疫反应等生命活动中起到了重要的作用。根据Swiss-Prot数据库的记录和预测，人类蛋白质中约有一半以上的蛋白质发生了糖基化。糖蛋白的组成、丰度的变化与疾病有着密切的联系，特别是在癌症发展过程之中，许多临床诊断标志物和治疗靶标如乳腺癌中的Her2/neu、前列腺癌中的前列腺特异性抗原、卵巢癌中的CA125等都是糖蛋白。因此，全面的分析研究蛋白质糖基化对于深入了解细胞生物学和疾病机理非常关键。目前，快速、高精度、操作简便的质谱技术在糖基化蛋白质组学的研究中得到了广泛的应用。然而，糖蛋白质组学的全面研究仍然存在着很多困难。很多临床上具有重要研究价值的糖蛋白均是低丰度蛋白，容易受到生物样品中其他高丰度非糖蛋白的干扰；糖蛋白或糖肽的离子化效率远远低于非糖蛋白或非糖肽，降低了糖蛋白或糖肽的质谱检测灵敏度；糖链结构复杂多样，质谱难以准确测定其化学结构和质量数。因此，在使用质谱方法分析复杂生物样品中的糖蛋白或糖肽之前，对样品中的糖蛋白或者糖基化肽段进行分离富集是十分必要的。

随着研究的不断深入，近年来发展了许多分离富集复杂样品中的糖基化蛋白和肽段的方法，比如凝集素亲和方法、抗体法、酰肼化学反应法、硼酸亲和色谱法、二氧化钛亲和法、亲水相互作用色谱法（HILIC）等。其中，亲水相互作用色谱法由于广泛的糖链特异性、富集过程简便、富集条件温和、重现性高而得到广泛应用；此外，HILIC方法利用高浓度的有机溶剂作为流动相，可以很好地兼容后续的质谱分析。目前HILIC方法已经开发出各种材料用于糖肽富集，包括琼脂糖，麦芽糖，两性离子聚合物和金属有机骨架等。由于葡萄糖、麦芽糖等和糖肽有相似结构，所以利用葡萄糖、麦芽糖等功能化修饰的HILIC材料与糖肽会有较好的相互作用。

石墨烯是一种新型的单原子层碳纳米材料，由于其独特的理化性能、超高的比表面积备受关注。磁性材料由于超顺磁性、快速分离、良好的生物相容性在蛋白质组学领域得到广泛应用。因此，基于磁性石墨烯基底的亲水性复合纳米材料在糖肽富集研究中有很大的潜力。

通过文献调研，目前还没有葡萄糖功能化修饰的磁性石墨烯材料应用在糖肽的富集研究中。结合磁性石墨烯材料超大比表面、快速分离等特点和葡萄糖特异性亲和糖肽特点，本发明首次合成了磁性石墨烯表面包覆聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和纳米金颗粒并修饰葡萄糖的纳米复合材料，应用于糖基化肽段的分离富集。大比表面积的磁性石墨烯材料通过聚(二烯丙基二甲基氯化铵)的静电吸附作用负载纳米金颗粒，再结合金-硫键相互作用在材料表面充分修饰了巯基化的葡萄糖，形成了具有很好亲水性的复合材料，对于复杂生物样品中的糖基化肽段具有选择性富集作用，大大提高了糖基化肽段的质谱信号，对于糖基化肽段的检测限可达0.25 fmol/μL，检测绝对量达到1ng。

本发明所涉及的磁性石墨烯表面包覆聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和纳米金颗粒并修饰葡萄糖的亲水性纳米复合材料，具有大比表面积，良好的生物相容性，快速磁性分离能力以及优异的亲水性，合成方法简单快速。此亲水性纳米复合材料可用于选择性富集生物样品中低丰度的糖基化肽，并用于质谱检测。

发明内容