[发明专利]一种肺癌相关基因突变检测方法、引物及试剂

权利要求书

1.一种肺癌相关基因突变检测方法、引物及试剂，其特征在于基于高通量测序技术检测肺癌相关基因EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA四种基因外显子的50个突变位点，包括如下：

且所述的突变位点1-50各自对应的多重PCR扩增引物依次为：

1)1-3的引物对：

上游引物：5’-TGTGGAGCCTCTTACACCCA-3’

下游引物：5’-GTGCCAGGGACCTTACCTTATAC-3’；

2)4-22的引物对：

上游引物：5’-ACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCA-3’

下游引物：5’-CTGAGGTTCAGAGCCATGGA-3’；

3)23-27的引物对：

上游引物：5’-CCACACTGACGTGCCTCTC-3’

下游引物：5’-GTCTTTGTGTTCCCGGACATAGT-3’；

4)28-29的引物对：

上游引物：5’-CGCAGCATGTCAAGATCACAGAT-3’

下游引物：5’-GCATGTGTTAAACAATACAGCTAGTG-3’；

5)30-36的引物对5：

上游引物：5’-CAAAGAATGGTCCTGCACCAGTAATAT-3’

下游引物：5’-AGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAA-3’；

6)37-40的引物对：

上游引物：5’-TCCTCATGTACTGGTCCCTCATT-3’

下游引物：5’-GTAAAAGGTGCACTGTAATAATCCAGACT-3’；

7)41-43的引物对：

上游引物：5’-CATACTTACCATGCCACTTTCCCTT-3’

下游引物：5’-TTTCTTTTTCTGTTTGGCTTGACTTGA-3’；

8)44-47的引物对：

上游引物：5’-CCACAAAATGGATCCAGACAACTGT-3’

下游引物：5’-GCTTGCTCTGATAGGAAAATGAGATCTA-3’；

9)48-49的引物对：

上游引物：5’-CAGAGTAACAGACTAGCTAGAGACAATGA-3’

下游引物：5’-GCACTTACCTGTGACTCCATAGAAA-3’；

10)50的引物对：

上游引物：5’-TGGAATGCCAGAACTACAATCTTTTGAT-3’

下游引物：5’-GTGGAAGATCCAATCCATTTTTGTTGTC-3’。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征还在于具体实施步骤如下：

(1)样本DNA提取：石蜡包埋组织或新鲜组织样本进行DNA提取，得到gDNA后进行浓度测定；

(2)目的片段扩增：将gDNA与多重PCR引物和PCR扩增试剂混合，经多重PCR反应，得到目的基因DNA片段；

(3)引物消除：将步骤(2)得到的DNA片段与引物消除试剂混合反应，降解去除PCR扩增片段中的引物序列，得到去引物的DNA片段；

(4)接头连接：将步骤(3)得到的DNA片段与P1接头、特异性接头、连接反应试剂混合进行连接反应，得到加接头的DNA片段；

(5)磁珠纯化：将加接头的DNA片段进行磁珠纯化，去除多余的小片段接头，得到纯化的DNA片段；

(6)文库扩增：将步骤(5)的DNA片段加入文库扩增反应液及文库扩增引物进行PCR扩增，并采用磁珠进行纯化，得到小片段的DNA文库；

(7)文库检测：将步骤(6)得到的文库采用荧光定量PCR的方法检测文库浓度；

(8)高通量测序：采用Ion Proton或Ion PGM测序平台对步骤(7)得到的文库进行高通量测序。

3.根据权利要求2所述的检测步骤，其特征还在于，步骤(2)中的反应体系为20μL体系，反应体系的组成成分具体为：

4.根据权利要求2所述的检测步骤，其特征还在于，步骤(2)中PCR反应的循环数为22。