[发明专利]一种肺癌相关基因突变检测方法、引物及试剂

说明书

技术领域

本发明设计基因测序领域，特别是高通量测序领域，具体是一种基于Ion Torrent测序平台的肺癌相关基因突变检测方法、一组引物对及试剂。

背景技术

肺癌是我国发病率和死亡率最高的癌症，其中非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC)约占所有肺癌的80％。目前化疗是治疗中、晚期肺癌的主要手段，也是患者术前、术后辅助治疗的方法之一。临床上部分患者化疗效果欠佳、化疗失败，其主要原因是肿瘤细胞对抗癌药物不敏感或产生耐药。因此，了解患者对化疗药物敏感性的相关因素，对于肺癌患者进行个体化治疗显得尤为重要。

EGFR基因位于7p12，编码酪氨酸激酶型受体。EGFR的酪氨酸激酶功能区由外显子18～24编码。EGFR与配体结合形成二聚体激活细胞内的激酶通路，进一步诱导下游通路的磷酸化，诱导细胞增殖。腺癌EGFR基因突变的发生率在亚洲人群达到50％，在不吸烟者、女性以及非粘液性肿瘤中发生率更高。迄今为止发现的EGFR基因突变主要位于外显子18～21，尤其是G719S和L861Q，与肿瘤细胞对酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的敏感度密切相关。EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)能特异性地抑制具有EGFR基因突变的非小细胞肺癌的生长，改善预后。因此，《非小细胞肺癌临床实践指南(中国版)》推荐，在使用酪氨酸激酶抑制剂治疗前，肺癌患者进行EGFR基因的突变检测。

KRAS基因位于12p12.1，是常见的致癌基因，KRAS突变在吸烟者以及粘液性肺腺癌中最常见，多达30％的肺腺癌有KRAS突变，是NSCLC的预后不良因素以及EGFR-TKI疗效不佳的预测指标。KRAS突变以点突变为主，常见12、13和61号密码子的突变。当KRAS基因正常时，能控制调控细胞生长的通路，抑制肿瘤细胞生长；当KRAS发生突变时，会导致细胞内信号传导紊乱，细胞增殖失控而癌变。根据2014年美国国立综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)的《非小细胞肺癌临床实践指南(中国版)》，KRAS突变和EGFR-TKI内源性耐药有关，KRAS野生型患者建议接受EGFR-TKI治疗，在患者使用EGFR-TKI药物治疗前，推荐进行KRAS基因的突变检测。

BRAF基因位于7q34，是一种原癌基因，BRAF基因编码一种丝/苏氨酸特异性激酶，是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK通路重要的转导因子，参与调控细胞内多种生物学事件，如细胞生长、分化和凋亡。非小细胞肺癌中BRAF突变率约为3％，其中大部分是肺腺癌。BRAF突变主要发生在15号外显子上的激活区：如V600E、V600K、V600D，其中有80％～90％是发生V600E突变，BRAF突变导致肺癌患者对EGFR-TKI出现耐药情况，因此检测BRAF基因突变对于指导肺癌患者的靶向用药具有重要意义。

PIK3CA基因位于3q26.3，PIK3CA编码I类PIK-3-激酶(PI3K)的p110催化亚单位。PIK3CA基因突变导致p110a酶活性增强，减少细胞对生长因子的依赖、抑制细胞的凋亡、促进肿瘤细胞的侵袭。研究结果表明，非小细胞肺癌中PIK3CA基因突变率为1％～4％。PIK3CA突变通常发生在第10和21号外显子，如E542K、E545K和H1047R。PI3K作为EGFR下游信号分子被激活，导致肿瘤细胞对EGFR-TKI等药物出现耐药。所以，检测PIK3CA基因突变，可以预测肺癌患者对EGFR-TKI等药物的耐药性，对于指导患者的靶向用药具有重要意义。

目前，常见的基因检测突变方法有Sanger测序法和荧光定量PCR法。Sanger测序法中，操作繁琐，灵敏度较低，假阴性率较高；荧光定量PCR法，每对引物只能检测一种突变，检测多突变位点操作繁琐，需要样本量较大。因此，采用灵敏度高、样本需求量少、可同时检测多位点突变的高通量测序法(NGS)更有利于可以研究和临床使用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于高通量测序平台的肺癌相关基因突变检测方法、一组引物对及试剂，以解决上述背景技术中提出的问题。本发明提供了一种肺癌相关基因基因突变的高通量检测方法，所述相关基因包括EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA 4个基因50种突变位点。

作为本发明进一步的方案：上述肺癌相关基因突变情况包括检测以下4个基因50种突变位点的突变情况：