[发明专利]一种制备烟酰胺单核苷酸的方法

说明书

提供了一种制备烟酰胺单核苷酸的方法，其是以烟酰胺、ATP和核糖为原料，在烟酰胺磷酸核糖转移酶、核糖磷酸焦磷酸激酶以及核糖激酶的催化作用下发生反应，制得烟酰胺单核苷酸。

技术领域

本发明涉及分子生物学与生物技术领域，特别涉及一种利用生物催化技术制备烟酰胺单核苷酸的方法。

背景技术

烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide mononucleotide，缩写成NMN)是生物细胞内存在的一种生化物质，它在被烟酰胺核苷酸腺苷转移酶腺苷化后即转化成生物细胞所赖以生存的重要物质烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD，又称辅酶I)，并且同时直接参与体内腺苷转移，其在生物细胞内的水平直接影响到NAD的浓度，在生物细胞能量生成中扮演着重要角色，并且对人体无危害。

截至目前，人们已经发现烟酰胺单核苷酸具有诸如延缓衰老、治疗帕金森等老年病、调节胰岛素分泌、影响mRNA的表达等诸多医疗保健用途，更多的用途还在不断研发出来。随着人们对烟酰胺单核苷酸药用及保健效果认知的增加，以及作为一种反应底物在化工方面的广泛应用，市场上对烟酰胺单核苷酸的需求量与日俱增。

目前，NMN的制备方法主要包括以下三种：1、酵母菌发酵法；2、化学合成法；3、生物催化法。其中，化学合成法具有成本较高且产生手性化合物的缺点；而酵母菌发酵法生产的NMN含一定有机溶剂残留；生物催化法因不含机溶剂残留，也不存在手性问题且制备的NMN与机体内的同型而成为目前最绿色环保无公害的NMN的制备方法。现有的制备NMN的生物催化法一般是以烟酰胺和5′- 磷酸核糖基-1′-焦磷酸(PRPP)为底物，在烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nicotinamid e phosphoribosyltransferase，缩写成Nampt)的催化下制备NMN。但是，因PRPP 的市场价格较高且来源受限，导致该生物催化法的生产成本较高，严重制约了其应用和发展。

因此，有必要开发一种无需使用PRPP作为底物的利用生物催化技术制备NMN 的新方法。

技术问题

针对上述背景技术中提到的现有的烟酰胺单核苷酸的制备方法存在的诸多问题，本发明的目的在于提供一种利用生物催化技术制备NMN的新方法，该方法可避开使用价格较高且来源受限的PRPP作为底物，具有价格低廉、绿色环保无公害、适宜大规模工业化生产等优点。

问题的解决方案

技术解决方案

为实验上述目的，发明人经过长期大量的实验摸索，终于开发出一种制备烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：以烟酰胺、ATP和核糖为原料，在烟酰胺磷酸核糖转移酶、核糖磷酸焦磷酸激酶以及核糖激酶的催化作用下发生反应，制得烟酰胺单核苷酸。

根据酶的国际系统命名法，上述方法中所使用的酶的EC编号分别为：烟酰胺磷酸核糖转移酶EC 2.4.2.12，核糖磷酸焦磷酸激酶EC 2.7.6.1，核糖激酶EC 2.7.1.15。

上述方法中所使用的各种酶的具体存在形式包括酶液、酶冻干粉、含酶细胞以及各种固定化酶和固定化含酶细胞，可以是未经纯化的粗酶形式，也可以是经部分纯化或完全纯化的形式。

为提高所使用酶的稳定性和重复利用率，以更好地完成上述催化反应并更进一步降低成本，上述方法中优选使用固定化酶。该固定化酶的制备方法大致为：用洗酶缓冲液(0.02M Tris-HCl/0.001M EDTA，pH7.0溶液)将酶稀释至蛋白含量为5-10mg/ml，再将酶稀释液与PB溶液(2.0mol/L磷酸二氢钾，pH7.5)等体积混合，然后加入酶固定化载体(50毫克酶/克载体)，于摇床(转速150rpm)中2 5℃反应20小时。反应完成后用滤袋过滤，用洗酶缓冲液清洗5-6次，即得固定化酶。其中的酶固定化载体可以选用环氧型LX-3000、二氧化硅、活性炭、玻璃珠以及大孔型聚N-氨乙基丙烯酰胺-聚乙烯等。

优选地，所述反应在温度为30-50℃，pH值为6.5-8.5的条件下进行。