[发明专利]显微可见的颗粒的高精度定量

说明书

该方法用于显微可见的颗粒的定量。提供过滤膜(116)，所述过滤膜(116)具有穿过该过滤膜(116)而限定的多个孔(138)。所述过滤膜(116)与真空室(104)操作接合。利用密封剂(140)密封所述孔。包含液体(144)和显微可见的颗粒(142)的样本液滴(126)被施加到所述过滤膜(116)上。所述液体(144)使设置在所述样本液滴(126)直接下方的孔(138e‑138h)中的密封剂(140)溶解。所述液体(144)流过其中密封剂(140)已被溶解的孔，并且所述显微可见的颗粒(142)留在所述过滤膜(116)的顶部。所述颗粒(142)在电子显微术中被计数。

技术领域

本发明涉及用于使用显微术(诸如扫描电子显微术(SEM))的显微可见(sub-visible)的颗粒(诸如微颗粒和/或纳米颗粒)的高精度定量的方法。

背景技术

从液体样本精确计数显微可见的颗粒(诸如病毒颗粒、类病毒颗粒、无机和聚合物珠、以及其它纳米颗粒和微颗粒)的数量在许多处理中是重要的。例如，经修改的病毒载体常用于基因治疗应用中。每mL的活性载体的数量(病毒样本的感染滴度)可以使用标准的感染性测定来确定。然而，通过使用当前可用的方法，不可能精确地确定样本中的颗粒(包括非感染颗粒)的总数量。感染颗粒与非感染颗粒的比率提供关于最终的基因治疗产品和上游发展过程的质量和疗效的无价信息。

当前可用技术(诸如定量流式细胞术(QFCM))的一个主要限制是感兴趣的纳米颗粒不被直接检测。相反，结合到一群纳米颗粒的探针的数量被定量。由于每个纳米颗粒结合的探针的数量变动，所以传统的间接技术的精度通常低，并且依赖于标本和探针之间的亲合性。感兴趣的纳米颗粒可以被直接检测的技术将克服该限制。而且，如果该技术将能够以足够的分辨率使颗粒可视化，则单个的颗粒可以基于它们的大小和形态被识别，因此被直接计数。甚至集群内的颗粒也可以被计数和估计。通过使用当前可用的亲合性方法或基于光散射的技术，这是不可能的。

发明内容

本发明的新颖的高精度直接颗粒方法可以被用于从液体样本对无机和有机显微可见的颗粒(诸如纳米颗粒)两者计数。另一个重要的特征是，标本的分布比以前可能的分布更均匀，并且这使对于取样的需要减少，并且现在可以以单个的颗粒可以被容易地识别的分辨率进行分析。显微可见的颗粒在不需要信号探针的情况下被直接检测，并且可以在正常的二维图像中被可视化。本发明的颗粒定量SEM(pqSEM)方法优选地基于低真空过滤、扫描电子显微术(SEM)或其它电子显微术技术和图像分析。本发明可以与内部标准一起或不与内部标准一起使用，内部标准的示例将是国家标准和技术协会(NIST)表征的聚苯乙烯珠。

本发明提供上述问题的解决方案。更特别地，该方法用于显微可见的颗粒的定量。提供过滤膜，所述过滤膜具有穿过该过滤膜而限定的多个孔。过滤膜与真空室操作接合。利用密封剂密封孔。包含液体与显微可见的颗粒的样本液滴被施加到过滤膜上。液体使位于样本液滴直接下方的孔中的密封剂溶解。液体流过其中密封剂已被溶解的孔，并且显微可见的颗粒留在过滤膜的顶部。颗粒设置在其上的过滤膜被移动到电子显微镜，并且在显微镜中获取的图像中被计数。

所述方法进一步包括将包含过滤膜的过滤器组件预先安装到SEM支撑体上的步骤。

所述方法进一步包括将安装带放置在SEM支撑体上的步骤。

所述方法进一步包括在使样本液滴沉积在过滤膜上之前提供具有限定在其中的细长通道的SEM支撑体、使用包含样本液滴的注入器以及使注入器在细长通道的顶部对齐的步骤。

所述方法进一步包括将SEM支撑体连接到与真空源连接的真空室和经由细长通道使过滤膜经受抽吸力的步骤。

所述方法进一步包括在样本液滴不触及过滤膜的任何外边缘的情况下使样本液滴沉积到过滤膜上的步骤。

所述方法进一步包括以下步骤：液体仅使设置在样本液滴直接下方的孔中的密封剂溶解，而液滴侧的相邻的孔保持被密封剂密封，因为液体尚未与设置在这些孔中的密封剂接触。