[发明专利]用于解脂酵母宿主细胞的CRISPR-CAS系统

权利要求书

1.一种非天然存在或工程化的组合物，其包含含有向导多核苷酸和Cas蛋白的CRISPR-Cas系统的来源，其中所述向导多核苷酸包含基本上为宿主细胞中靶多核苷酸的反向互补体的向导序列，并且所述向导多核苷酸能够引导所述Cas蛋白结合在所述宿主细胞中的靶多核苷酸处以形成CRISPR-Cas复合物，其中所述向导序列基本上为所述宿主细胞的基因组中的5’-(N)yPAM-3’多核苷酸序列靶标的(N)y部分的反向互补体，其中y为8-30的整数，其中PAM为前间区序列邻近基序，其中所述宿主细胞为解脂酵母，优选耶氏酵母属(Yarrowia)，更优选解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)，甚至更优选解脂耶氏酵母CLIB122或解脂耶氏酵母ML324(以ATCC18943号保藏)，并且其中PAM优选为选自以下的序列：5’-XGG-3’、5’-XGGXG-3’、5’-XXAGAAW-3’、5’-XXXXGATT-3’、5’-XXAGAA-3’、5’-XAAAAC-3’，其中X可以为任何核苷酸或其类似物，优选X可以为任何核苷酸；并且W为A或T。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述Cas蛋白由多核苷酸编码和/或所述向导多核苷酸由多核苷酸编码或存在于多核苷酸上。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述Cas蛋白由多核苷酸编码和/或所述向导多核苷酸由另一多核苷酸编码或存在于另一个多核苷酸上，并且一个或多个所述多核苷酸包含在载体中。

4.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述向导多核苷酸由被转录以提供实际的向导多核苷酸的多核苷酸编码。

5.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中编码向导多核苷酸的多核苷酸与载体具有序列同一性，使得有利于编码向导多核苷酸的所述多核苷酸与所述载体的重组，其中所述重组优选为所述宿主细胞中的体内重组，并且其中所述载体优选为线性的。

6.根据权利要求5所述的组合物，其包含至少两个不同的多核苷酸，所述多核苷酸各自编码相应的不同向导多核苷酸，其中所述至少两个多核苷酸还彼此具有序列同一性，使得有利于编码不同向导多核苷酸的所述多核苷酸与所述载体的重组，其中所述重组优选为所述宿主细胞中的体内重组，并且其中所述载体优选为线性的。

7.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述Cas蛋白由多核苷酸编码并且所述向导多核苷酸由另一多核苷酸编码或存在于另一个多核苷酸上，并且所述多核苷酸包含在一个载体中。

8.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述Cas蛋白由包含在载体中的多核苷酸编码，并且所述向导多核苷酸由包含在另一载体中的另一多核苷酸编码或存在于包含在另一载体中的另一多核苷酸上，其中优选地编码Cas蛋白的所述载体是低拷贝载体，并且编码向导多核苷酸的所述载体是高拷贝载体。

9.根据权利要求8所述的组合物，其中一个或更多个或所有载体包含选择性标记，优选每个载体包含不同的选择性标记。

10.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其还包含在CRISPR-Cas复合物切割所述靶多核苷酸后与所述靶多核苷酸重组产生经修饰的靶多核苷酸的一个或更多个不同的外源性多核苷酸。

11.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中存在至少两个不同的外源性多核苷酸，所述外源性多核苷酸在所述CRISPR-Cas复合物切割所述靶多核苷酸后与所述靶多核苷酸重组产生经修饰的靶多核苷酸，其中所述至少两个不同的外源性多核苷酸彼此具有序列同一性，使得有利于所述不同的外源性多核苷酸的重组，其中所述重组优选为所述宿主细胞中的体内重组。