[发明专利]用于解脂酵母宿主细胞的CRISPR-CAS系统

说明书

本发明涉及分子生物学和细胞生物学的领域。更具体地，本发明涉及一种用于解脂酵母宿主细胞的CRISPR‑CAS系统。

发明领域

本发明涉及分子生物学和细胞生物学的领域。更具体地，本发明涉及一种用于解脂酵母宿主细胞的CRISPR-CAS系统。

发明背景

基因组学技术和分析方法的最新进展显著加速了例如对与范围广泛的生物功能和疾病相关联的遗传因子进行编目和图谱化的能力。精确的基因组工程化技术对于通过允许各遗传元件的选择性干扰而使得因果性遗传变异的系统性反向工程成为可能，其也是推进合成生物学、生物技术应用和医学应用需要的。虽然基因组编辑技术，诸如设计师锌指、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)或归巢大范围核酸酶(homing meganuclease)可用于产生靶向的基因组干扰，但是仍然需要负担得起的、易于建立的、可扩展的并且便于靶向基因组内的多个位置的新的基因组工程技术。工程化大范围核酸酶对于大多数学术研究者一直是具有挑战性的，因为这些酶的DNA识别和切割功能缠结在单结构域中。也已经证明稳健地构建工程化锌指阵列对于许多实验室是困难的，这是由于需要考虑阵列中各指结构域之间的环境依赖性效应。因此，对于用于靶向具有一系列广泛应用的宿主细胞内的特异性序列的替代性且稳健的技术存在着迫切需要。

发明概述

本发明解决上述需要并且提供了这种技术。本发明是基于CRISPR-Cas系统，其不要求产生靶标特异性序列的定制蛋白，而是需要单一Cas酶，所述单一Cas酶可通过向导多核苷酸而进行编程来识别特异性多核苷酸靶标；换句话说，可以使用所述向导多核苷酸分子将Cas酶募集到特异性多核苷酸靶标。将CRISPR-Cas系统添加到基因组学技术和分析方法的组库中可以显著简化分子学生物领域中现有的方法。

本发明提供了一种非天然存在或工程化的组合物，其包含含有向导多核苷酸和Cas蛋白的CRISPR-Cas系统来源，其中向导多核苷酸包含基本上为宿主细胞中靶多核苷酸的反向互补体的序列，并且向导多核苷酸可以引导Cas蛋白结合在宿主细胞中的靶多核苷酸处以形成CRISPR-Cas复合物。

本发明还涉及一种调节细胞中多核苷酸的表达的方法，所述方法包括使宿主细胞接触根据本发明的组合物，其中向导多核苷酸引导Cas蛋白结合在宿主细胞中的靶多核苷酸处以形成CRISPR-Cas复合物。

本发明还涉及一种宿主细胞，其包括根据本发明的组合物。

本发明还涉及一种产生宿主细胞的方法，所述方法包括使宿主细胞接触根据本发明的组合物，其中向导多核苷酸引导Cas蛋白结合在宿主细胞中的靶多核苷酸处以形成CRISPR-Cas复合物。

本发明还涉及一种用于产生目标化合物的方法，所述方法包括在有利于目标化合物的条件下培养根据本发明的宿主细胞，以及任选地纯化或分离目标化合物。

附图简述

图1示出典型的向导多核苷酸的示例。两种向导多核苷酸为包含向导序列(crRNA)和向导多核苷酸结构组分的向导RNA。在上图中，向导多核苷酸结构组分由彼此杂交的两个单独分子构成；单个组分可以称之为tracr序列和tracr伴侣序列。在下图中，向导多核苷酸结构组分由具有内部杂交的单一分子构成。这个图改编自Sander和Joung,2014和Mali等人,2013。

图2示出如何构建向导多核苷酸(向导RNA自加工核酶缩写为gRSR)。锤头状核酶和HDV核酶切割RNA分子，形成最终的且功能性的成熟向导多核苷酸(向导RNA)。

图3示出载体MB6238，其含有针对酿酒酵母(S.cerevisiae)的URA3标记和CEN/ARS序列、大肠杆菌ori和针对大肠杆菌的氨苄青霉素抗性标记。