[发明专利]生产酵母突变体的方法及其用途

说明书

本申请涉及生产酵母突变体的方法，其间至少一个酵母株在第一诱变步骤中与第一诱变剂接触并且在第二诱变步骤中与第二诱变剂接触，以及通过该方法产生的酵母和这类酵母的用途。

近年来，许多葡萄种植区在酿酒葡萄成熟期的气温急剧上升，其也增加了通过这种方式成熟的葡萄的糖含量。在用于生产葡萄酒的乙醇发酵的情况下，通过使用酵母株将该糖，特别是葡萄糖转化为乙醇作为主要的发酵产物。近年来，在用于生产葡萄酒的乙醇发酵的情况下，出现了如下问题：因为葡萄中葡萄糖含量增加，生产的葡萄酒呈现升高的酒精含量。消费者不希望这样的高酒精含量，即使在不同的年份，消费者更喜欢单独葡萄酒中的酒精含量尽可能一致。酒精含量较低的葡萄酒的需求量也在近期有所增加。此外，葡萄酒中的乙醇代表着这样一种成分，其一方面是必需和可取的，但是在含量较高的情况下，可能会导致葡萄酒的风味品质受损。高甘油浓度，例如超过10克/升，对葡萄酒的风味特性有积极作用。

提供这些性质的尝试包括使用已知的酵母，其在汁(must)中针对相同量的糖产生较少乙醇。一些这样的酵母是已知的；特别是用于生产高品质的葡萄酒，然而，希望有一些不同的酵母可供选择，其产生可显着影响葡萄酒风味特性的其他次生物质而不是乙醇。

生产这种酵母的尝试具体包括有意的遗传修饰和常规培育以及基于常规培育的选择过程。在WO 2011/080411中公开了产生具有所需性质的酵母的这种方法的示例。具体遗传修饰的生物体的缺点是消费者对这些生物体存在高度怀疑。培育方法和基于常规培育和纯选择过程的方法也可能是可行的，但是方法耗时非常长因此成本非常高。或者，野生酵母也被分离并测试所需的性质。这种分离描述于EP 2 634 247 B1中。这个过程成本也是非常高，它的成功是不确定的。

在本文中，本发明的目的在于制备在乙醇发酵过程中在给定的糖含量下产生比前述使用的株低的乙醇含量和高的甘油含量的酵母，并且它们可同时快速获得。

该目的通过上述类型的方法实现，其中第一和第二诱变剂彼此不同，并且选自以下组：核苷酸-烷基化剂，核苷酸-脱氨基剂和UV辐射，并且第一选择步骤在第一和第二诱变步骤之间进行，并且在第二诱变步骤之后进行第二选择步骤，由此将从相应的前述诱变步骤得到的突变体暴露于选自下组的选择因素：(a)高渗培养基和(b)醇脱氢酶抑制剂。

已经看到，在这种方法中，在其间进行两个诱变步骤，由此在每个诱变步骤之后额外进行选择步骤，产生酵母，其在给定糖浓度下的酒精发酵过程中比所用的初始株一方面提供较低的乙醇含量，另一方面在相同条件下产生较高的甘油浓度。两者都对使用这种酵母产生的葡萄酒的味道有积极作用。

本文所用的术语“酵母”优选是指酵母属的酵母，特别优选涉及酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或贝酵母(Saccharomyces bayanus)。这也包括亚种，如酿酒酵母亚种贝酵母。

二倍体酵母株优选用作本发明方法中的第一诱变步骤的前述的株。在进行突变的情况下，二倍体不丢失，因此最终产生的酵母突变体也是二倍体。二倍体酵母的优点是它们的性质保持几代相对稳定，因此特别适合作为纯酵母。然而，这种性质会导致非特异性突变，例如通过辐射或诱变剂触发，这似乎没有意义。现在惊奇地看到，通过将这种非特异性突变的手段，即核苷酸-烷基化剂，核苷酸脱氨基剂或UV辐射与选择和重复突变以及进一步选择相结合，产生具有所需性质的酵母突变体，即，减少乙醇生产和增加甘油生产。

术语“核苷酸-烷基化剂”描述了在烷基和DNA碱基之间形成共价键的物质。这种修饰的碱基可导致碱基错配，从而导致点突变。已知多种引起这种烷基化的物质。

术语“核苷酸-脱氨基剂”描述了从DNA碱基分割氨基的物质。这种分割也导致碱基错配，即点突变。已知多种引起这种脱氨基化的物质。

这里使用的术语“UV辐射”是指400nm至100nm波长范围内的电磁辐射，特别是290nm至100nm波长范围内的UV-C辐射。280nm至240nm，特别是254nm的波长范围是优选的。优选的辐射强度为1000μJ/cm²至3000μJ/cm²，特别优选为2000μJ/cm²。这种辐射对DNA的影响导致形成嘧啶二聚体，特别是胸腺嘧啶二聚体。这些二聚体影响DNA的三维结构，并在复制过程中阻断DNA聚合酶。