[发明专利]捕获、检测和定量小RNA的方法、组合物与试剂盒

权利要求书

1.一种用于检测成熟小RNA的非治疗和非诊断方法，所述方法包括：

提供包含成熟小RNA的样本；

使所述成熟小RNA的3’端聚腺苷酸化，并且在单链RNA连接酶存在的状态下将单链衔接子连接至所述成熟小RNA的5’端，由此形成RNA连接产物，其中所述衔接子包含通用正向引物部分；

使用反转录引物反转录所述RNA连接产物，从而形成所述RNA连接产物的cDNA产物，其中所述反转录引物包含poly(T)部分和尾巴部分，其中所述尾巴部分包含通用反向引物部分；

使用第一正向引物和反向引物对扩增所述cDNA产物以形成扩增产物，其中第一正向引物能够与所述通用正向引物部分或其互补序列杂交，并且第一反向引物能够与所述通用反向引物部分或其互补序列杂交；以及

通过定量实时聚合酶链反应(qPCR)检测对应于所述成熟小RNA的扩增产物，

其中所述cDNA产物扩增为预扩增步骤，所述聚腺苷酸化、连接和反转录步骤在相同反应容器中进行，并且所述聚腺苷酸化、连接、反转录以及预扩增步骤被连续执行而不干扰提取、沉淀、纯化和/或其他净化过程。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述预扩增步骤包括2至14个扩增循环。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测包括使用标记的检测器探针的qPCR，其中所述检测器探针包含特异于所述成熟小RNA的部分。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测包含使用第二正向引物和反向引物对的qPCR，其中所述第二正向引物和第二反向引物中的至少一者包含特异于所述成熟小RNA的部分。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚腺苷酸化、连接、反转录和扩增步骤在不干扰反应产物的纯化的情况下进行。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚腺苷酸化步骤在所述连接步骤之前进行。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述连接步骤在所述聚腺苷酸化步骤之前进行。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述反转录步骤和所述预扩增步骤在所述相同反应容器中同时进行。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述连接步骤和反转录步骤在相同反应容器中同时进行。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述连接步骤、反转录步骤和预扩增步骤在相同反应容器中同时进行。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述成熟小RNA选自由微小RNA(miRNA)、短干扰RNA(siRNA)、重复序列相关siRNA(rasiRNA)、反式作用siRNA(tasiRNA)、Piwi交互作用RNA(piRNA)、短发夹RNA(shRNA)和21-URNA组成的组。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述包含成熟小RNA的样本选自由单独制备的总RNA、细胞提取物、完整细胞、来自体外转录反应的样本和来自化学合成的样本组成的组。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述包含成熟小RNA的样本由生物组织、血清、血浆或尿液制备。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述包含成熟小RNA的样本由全血制备。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述衔接子为RNA分子。

16.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括在所述连接和/或预扩增步骤中增加封闭寡核苷酸。