[发明专利]捕获、检测和定量小RNA的方法、组合物与试剂盒

说明书

本发明提供了用于捕获、检测和定量成熟小RNA的方法、组合物与试剂盒。所述方法的实施例包括通过将一个5'连接衔接子连接至5'端并且使3'端聚腺苷酸化以对成熟小RNA的5'端和3'端加尾。其他实施例包括通过一个通用反转录引物反转录连接衔接子的聚腺苷酸化成熟小RNA以及通过通用引物扩增cDNA。

相关申请的交叉引用

本专利申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2015年3月13日提交的美国临时专利申请No.62/133,185的权益，该美国临时专利申请的全部内容完整并入本文作为参考。

技术领域

本教导内容涉及分子及细胞生物学领域，具体地涉及检测目标多核苷酸诸如小RNA种类的领域。

引言

小分子、非编码调控RNA种类诸如微小RNA(miRNA)是一系列丰富的调控元件，已被证明影响植物和动物正常细胞过程的各个方面，包括细胞死亡、分化和增殖。miRNA还涉及许多疾病，包括癌症、心脏病和神经疾病，因此，miRNA被作为诊断和预后生物标志物进行研究。包括miRNA在内的小RNA通过特异性酶复合物由较大的RNA前体产生。一般来讲，成熟miRNA由一段包含20-30个核苷酸的高度保守的核心序列组成，并且通常具有一种5'-末端单磷酸酯和一个3'-末端羟基基团。miRNA通常通过结合至目标mRNA的所述3'-UTR内的靶位点来诱导基因沉默。此交互作用抑制蛋白质合成和/或引发mRNA降解。

检测、定量和分析成熟小RNA诸如miRNA的尝试受到过若干因素的阻碍，其中包括小RNA较小的尺寸以及相关但不同种类之间的相似性。密切相关的miRNA家族成员可能只有一个核苷酸存在差异，因此需要高特异性和区分单一核苷酸错配的能力。

核酸微阵列法已被用于定量成熟小RNA，但是此方法需要高浓度的输入标靶以实现高效杂交。尽管所述较大的前体可以通过PCR进行扩增，但成熟小RNA的所述较小的尺寸妨碍了通过定量或反转录酶聚合酶链反应(PCR)对其进行扩增。已开发出有利于成熟小RNA的PCR扩增的方法。例如，通过添加至少一个寡核苷酸衔接子延长成熟小RNA。仍然需要一种捕获、检测和分析小RNA的方法，在关于下列属性中的至少一者上改善现有技术：灵敏度、速度、效率和成本效益。

发明概述

本文提供了用于捕获和检测成熟小RNA的方法、组合物与试剂盒。在某些实施例中，本教导内容提供了用于从样本中捕获、检测和定量成熟小RNA诸如微小RNA(miRNA)的方法，该方法包括使所述RNA的3'端聚腺苷酸化、将单链通用衔接子连接至所述RNA的5'端，以及通过通用反转录(RT)引物反转录所述连接衔接子的聚腺苷酸化RNA。所得的反转录产物包含所述成熟小RNA的cDNA以及连接的衔接子，该连接的衔接子在所述5'端具有通用RT引物。此cDNA产物可被捕获和/或检测，或使用添加至所述5'端和3'端两者的通用序列，可使用单配对通用正向和反向引物对cDNA产物进行通用预扩增和/或扩增。在此类扩增反应后，可捕获和/或检测基于所述成熟小RNA的扩增子。在某些实施例中，该目标成熟小RNA为一个miRNA。

在某些实施例中，本文提供了一种用于检测成熟小RNA的方法，该方法包括：对于包含成熟小RNA的样本，使所述成熟小RNA的3'端聚腺苷酸化并且在单链RNA连接酶存在下将一个单链衔接子连接至所述成熟小RNA的5'端以形成一个RNA连接产物，其中该衔接子包含一个通用正向引物部分；使用一个反转录(RT)引物反转录所述RNA连接产物以形成该RNA连接产物的一个cDNA产物，其中该RT引物包含一个poly(T)部分和一个尾巴部分并且该尾巴部分包含一个通用反向引物部分；使用一组第一正向和反向引物对扩增所述cDNA产物以形成一个扩增产物，其中所述第一正向引物可与所述通用正向引物部分或其互补序列杂交，并且所述第一反向引物可与所述通用反向引物部分或其互补序列杂交；以及通过定量实时聚合酶链反应(qPCR)检测对应于所述成熟小RNA的扩增产物。