[发明专利]通过注射进行的基于液滴的选择

权利要求书

1.一种用于在微流体装置中鉴定编码感兴趣的酶的多核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供包含编码一种或多种酶的多核苷酸的文库的微流体液滴的乳液，其中每个液滴包含该文库的至多单个成员，所述文库被包含在原核宿主细胞内，并且表达该多核苷酸的文库以产生该一种或多种酶；

b)将包含该一种或多种酶的底物的等分试样引入每个液滴中，其中一种或多种感兴趣的活性酶的存在将该底物转化成可筛选的产物；

c)确定含有高于预定的阈值水平的可筛选产物的阳性液滴，该预定的阈值水平反过来又确定阴性液滴；

d)引入包含核苷酸、合适的DNA聚合酶和一组PCR引物的浓缩PCR溶液的等分试样，其允许将编码该一种或多种感兴趣的酶的该多核苷酸PCR扩增到在步骤(c)中确定的每个阳性液滴中；和将导致DNA变性以及酶变性和细胞裂解的溶液的等分试样引入在步骤(c)中确定的该阴性液滴中；

e)从该阳性液滴中克隆或PCR扩增编码该一种或多种感兴趣的酶的该多核苷酸；和

f)从在步骤(e)中的该克隆或PCR扩增的多核苷酸鉴定编码感兴趣的酶的多核苷酸。

2.如权利要求1所述的方法，其中该感兴趣的酶是水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶。

3.如权利要求2所述的方法，其中该感兴趣的酶是一种α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、天冬酰胺酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、葡聚糖转移酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、或转谷氨酰胺酶。

4.如权利要求2所述的方法，其中该感兴趣的酶是淀粉酶、纤维素酶、果胶分解酶、或木聚糖酶。

5.如权利要求2所述的方法，其中该感兴趣的酶是纤维二糖水解酶或内切葡聚糖酶。

6.如权利要求1所述的方法，其中该文库编码一种或多种水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶。

7.如权利要求6所述的方法，其中该文库编码一种或多种α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、天冬酰胺酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、葡聚糖转移酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、或转谷氨酰胺酶。

8.如权利要求6所述的方法，其中该文库编码一种或多种淀粉酶、纤维素酶、果胶分解酶、或木聚糖酶。

9.如权利要求7所述的方法，其中该文库编码纤维二糖水解酶或内切葡聚糖酶。

10.如权利要求1所述的方法，其中该文库编码相同酶的不同变体。

11.如权利要求1所述的方法，其中该文库包含编码相同酶的两种或更多种不同的多核苷酸。

12.如权利要求1所述的方法，其中该文库被包含在革兰氏阳性宿主细胞内。

13.如权利要求12所述的方法，其中在步骤(a)中的每个液滴包含至多单个宿主细胞。

14.如权利要求1所述的方法，其中该一种或多种酶的该底物是荧光的，并且其中该酶的活性将该荧光底物转化为荧光产物。

15.如权利要求1所述的方法，其中该编码感兴趣的酶的多核苷酸通过该多核苷酸的DNA测序在步骤(f)中被鉴定。