[发明专利]通过注射进行的基于液滴的选择

说明书

一种用于在微流体装置中鉴定编码感兴趣的酶的多核苷酸的方法，该方法通过以下各项进行：提供包含编码一种或多种酶的多核苷酸的文库的微流体液滴的乳液，引入允许将该多核苷酸PCR扩增到选择的液滴中的浓缩PCR溶液和/或将致死溶液引入取消选择的液滴中，并且鉴定编码感兴趣的酶的多核苷酸。

技术领域

本发明涉及一种微流体或“芯片实验室”方法。更具体地说，它涉及如何使用流体注射作为在不可混合的载体流体中选择或取消选择水滴的一种手段。水滴有时被称为微滴或微胶囊，它们通常具有约20微米的平均直径，并且被用作隔室或微小的反应容器。它们可以含有例如分泌酶的活微生物细胞。液滴还可以含有其他组分，例如荧光酶底物，该荧光酶底物可以显示由液滴内的微生物细胞产生的酶的活性。

背景技术

已经在1999年(WO 99/02671)描述了分离编码具有所希望的活性的基因产物的一种或多种遗传因子的一般概念，其包括以下步骤：(a)将遗传因子分隔成微胶囊；(b)表达遗传因子以便在微胶囊内产生它们各自的基因产物；(c)分选产生具有所希望的活性的基因产物的遗传因子。

已经描述了使用微胶囊中的体外表达系统以及乳化稳定的化学惰性的基于硅酮的表面活性剂(WO 03/044187)。

例如通过施加电场，已经实现了微滴的操纵，包括几个液滴的合并或聚结(WO2007/089541)。

可以获得许多综合评论，并且许多微流体组分都可商购获得。微流体领域正在快速发展，并且任何潜在的改进都是高度希望的。

发明内容

本方法的发明人已经表明，编码感兴趣的酶的多核苷酸的鉴定可以在微流体装置中非常有效地通过以下各项进行：提供包含编码一种或多种酶的多核苷酸的文库的微流体液滴的乳液，引入浓缩PCR溶液，其允许将多核苷酸PCR扩增到选择的液滴中和/或将致死溶液引入取消选择的液滴中，然后鉴定编码感兴趣的酶的多核苷酸。

相应地，本发明提供了在微流体装置中鉴定编码感兴趣的酶的多核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供包含编码一种或多种酶的多核苷酸的文库的微流体液滴的乳液，其中每个液滴包含文库的至多单个成员，并表达多核苷酸的文库以产生一种或多种酶；

b)将包含一种或多种酶的底物的等分试样引入每个液滴中，其中一种或多种感兴趣的活性酶的存在将底物转化成可筛选的产物；

c)确定含有高于预定的阈值水平的可筛选产物的阳性液滴，该预定的阈值水平反过来又确定阴性液滴；

d)引入包含核苷酸、合适的DNA聚合酶和一组PCR引物的浓缩PCR溶液的等分试样，其允许将编码一种或多种感兴趣的酶的多核苷酸PCR扩增到在步骤(c)中确定的每个阳性液滴中；和/或将导致DNA变性以及酶变性和/或细胞裂解的溶液的等分试样引入在步骤(c)中确定的阴性液滴中；

e)从阳性液滴中克隆或PCR扩增编码一种或多种感兴趣的酶的多核苷酸；和

f)从在步骤(e)中克隆或PCR扩增的多核苷酸鉴定编码感兴趣的酶的多核苷酸。

定义

编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由开放阅读框架决定，该开放阅读框架从起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。