[发明专利]鉴定并验证亲和试剂的方法

说明书

序列表

本专利申请包含序列表，其已经以ASCII格式电子提交，并且据此全文以引用方式并入。创建于2016年2月12日的所述ASCII拷贝名称为50881_011WO2_Sequence_Listing_2_12_16_ST25.txt，并且大小为5150字节。

技术领域

本发明涉及鉴定并验证能够结合靶多肽的亲和试剂。

发明背景

用于产生抗体的最常用的方法是通过动物免疫产生。然而，这种方法一般来讲是低通量的、昂贵的、耗时的，并且产生的抗体不总是可再生的。此外，无中间验证步骤以确保针对半抗原分离的此类抗体将有效地结合全长抗原。替代方法是产生重组抗体（rAb），该方法目前通过以下几种方法完成：（i）小鼠杂交瘤和（ii）重组展示技术。小鼠杂交瘤方法昂贵并且可能导致亲和试剂的异质集合。此外，基于杂交瘤的方法可能常常耗费几个月来产生rAb，并且无进一步操作的情况下得不到DNA序列信息。不涉及动物的重组展示技术可为自动的并且能够仅在几周内产生可用的rAb。通过展示技术产生的rAb通过在合适异源宿主中的过表达是可再生的，并且易于以DNA形式储存和传递。然而，当前的展示技术成本高且通量低。因此，本领域需要开发高效的、成本可接受的、并且可广泛应用的方法以产生可再生的亲和试剂，例如重组抗体。

发明内容

本发明特征在于鉴定并验证亲和试剂如抗体（例如IgG、scFv、Fab、和本领域已知的其它抗体类型）的方法。本发明的方法主要涉及通过例如细菌（例如大肠杆菌（E. coli））上的噬菌体展示筛选抗体文库，从而鉴定能够结合期望靶多肽的特定抗体克隆。以此方式鉴定的克隆可随后利用双杂交系统（例如酵母双杂交）进行验证。在一些情况下，抗体可通过它们结合半抗原（半Ag）的能力进行鉴定。在某些情况下，通过它们结合半抗原的能力鉴定的抗体可通过它们结合全长抗原（FL-Ag）的能力进行验证。验证过的克隆可通过另外几轮噬菌体展示和/或酵母双杂交进一步进行筛选。在每轮之间，可进一步修饰特定克隆的变体，例如通过本文所述的AXM克隆方法进行修饰，用于产生另外的克隆变体，可筛选它们以鉴定对所关注靶显示更高的结合亲和力的变体。

在第一方面，本发明特征在于鉴定并验证能够结合靶多肽的结合部分的方法。该方法涉及：

(a)提供多种病毒，每种病毒包括：

编码结合部分的核酸，其中结合部分展示在病毒表面；

(b)与靶多肽或其肽片段一起温育多种病毒；

(c)检查病毒展示的结合部分是否结合靶多肽或其肽片段；

(d)对于每个鉴定为能够结合靶多肽的结合部分，在细胞中表达：

（i）第一融合蛋白，其包括鉴定为能够结合靶多肽的特定结合部分和第一报告部分，以及

（ii）第二融合蛋白，其包括靶多肽或其肽片段，以及第二报告部分，

其中特定结合部分与靶多肽或其肽片段的结合导致细胞中可检测基因的表达，其中该可检测基因的表达处于第一报告部分和第二报告部分的控制之下；并且

(e)测定是否每个细胞表达可检测基因，从而验证鉴定为能够结合靶多肽的结合部分能够与靶多肽结合。

在第一方面的一些实施方案中，该方法还涉及在检查步骤之后并在表达步骤之前，给编码每个鉴定为结合靶多肽或其肽片段的结合部分的核酸测序。给此类核酸测序的方法可包括例如本领域已知的任何测序方法（例如深度测序和桑格（Sanger）测序）。

在第一方面的一些实施方案中，在检查步骤和测序步骤中将多个结合部分鉴定为能够结合靶多肽，并且该方法还包括根据步骤（d），在不同细胞中表达每个鉴定的结合部分，以及根据步骤（e）测定是否每个不同细胞表达所述可检测基因。在某些实施方案中，该方法还包括产生至少一个验证过的结合部分的多个变体，并且使用多个变体作为步骤（a）的结合部分重复步骤（a）-（e）。在特定实施方案中，重复步骤（a）-（e）至少两次（例如2、3、4、5、6、7、8、9、或10次）。在一个实施方案中，重复步骤（a）-（e）一次。

在第二方面，本发明特征在于验证在结合部分和靶多肽之间的结合相互作用的方法。该方法涉及：

在细胞中表达：

(a)第一融合蛋白，其包括结合部分和第一报告部分，以及

(b)第二融合蛋白，其包括靶多肽或其肽片段，以及第二报告部分；

通过以下步骤已经将结合部分鉴定为能够结合靶多肽：

（i）在病毒上表达编码结合部分的核酸，其中结合部分展示在病毒表面，