[发明专利]阴离子通道视紫红质的组合物及其使用方法

说明书

用于鉴别和表征源自于藻类的一类新的视紫红质的方法和组合物，其为高度敏感和有效的阴离子传导的通道视紫红质。这些阴离子传导的通道视紫红质的视紫红质域已在哺乳动物系统中克隆和表达且因此尤其可用于光基因应用中并且作为电活性细胞介导的病症的治疗剂。

本申请要求2015年3月19日提交的美国临时申请序号62/135,470、2015年4月20日提交的序号62/149,812以及2015年12月1日提交的序号62/261,821的优先权权益，这些申请的全部内容以引用的方式并入。

本发明在国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的资助号R37GM027750、R21MH098288及S10RR022531下在美国政府支持下完成。政府对本发明享有一定权利。

发明背景

1.发明领域

本公开总体上涉及利用来源于藻类的通道视紫红质且更具体地阴离子传导的通道视紫红质的方法和组合物，所述阴离子传导的通道视紫红质对于光基因应用或治疗剂使用具有新型特征。

2.现有技术的描述

光基因(Deisseroth.Nat Methods 8(1)：26-9，2011)是指使用光学方法来探测和控制完整的神经回路内的遗传靶向神经元。光基因涉及光激活的通道和酶的引入，由此允许以毫秒精度操控神经活动，同时通过使用特定的靶向机制维持细胞类型分辨。因为大脑为一个高速的系统，所以毫秒尺度的时间精度对于光基因概念来说很重要，这允许探测特定的动作电位模式在所限定的细胞中的因果作用。

在绿色有鞭毛的藻类中运动行为的光控制(趋光性和避光反应)是由与原核生物中的趋光性受体和光驱动的离子转运蛋白同源的感觉视紫红质来介导。在趋光性过程中，海藻的感觉视紫红质的激发造成跨膜光感受器电流的产生。当在动物细胞中表达时，海藻趋光性受体用作光门控阳离子通道，其被称为“通道视紫红质”。通道视紫红质成为了细胞活动的光控制的有用的分子工具。

最初，这些光激活通道和酶的来源为若干微生物视蛋白，包括通道视紫红质-2(ChR2)，即来自藻类的单组分光激活的阳离子通道，其在哺乳动物中允许毫秒尺度的时间控制，仅需要一个基因表达以便发挥作用并对具有发色团(视黄醛)的可见光谱的光作出反应，所述发色团已经存在并通过哺乳动物脑组织供应给ChR2。ChR2的实验效用在从有行为的哺乳动物到如苍蝇、蠕虫和斑马鱼的经典模型生物体的多种动物模型中得到快速证明，并且数百组采用了ChR2及相关微生物蛋白来研究神经回路。目前，此家族的若干成员已经募集作为用于光基因的分子工具，即用光来调节细胞活动。来自绿色(绿色植物)有鞭毛的藻类(6)的趋光性受体，最有名的是通道视紫红质(ChR)，由于其可用作光门控阳离子通道而被广泛用于使易兴奋细胞的遗传目标群体去极化。

视紫红质离子泵的超极化已用于抑制神经元激发，但其每个捕获的光子仅转运单个电荷且因此具有有限的能力。近来，ChR被工程化以传导Cl-，但这些光基因工具仍保留一些阳离子电导并且在额外的突变下可以是高度感光的，仅以极大地减缓慢通道动力学为代价(J.Wietek等人，Science344，409(2014)及A.Berndt，S.Y.Lee，C.Ramakrishnan，K.Deisseroth，Science 344，420(2014))。对于光基因超极化来说理想的是通过演化为高度传导性和阴离子选择性的而优化的天然光门控的阴离子通道。

本文描述了来源于一类新鉴别的通道视紫红质、即阴离子通道视紫红质(ACR)、光门控阴离子通道的经修饰和优化的视紫红质域，其通过光门控的氯离子传导提供高度敏感和有效的膜超极化和神经元沉默。

发明概要