[发明专利]核酸分子的检测有效

专利信息
申请号: 201680024364.0 申请日: 2016-04-29
公开(公告)号: CN107873058B 公开(公告)日: 2022-08-02
发明(设计)人: 迈克·施皮克曼;尼纳·温特;因加·弗洛尔;加赞费尔·贝尔格 申请(专利权)人: 米尔德泰克特有限责任公司
主分类号: C12Q1/6851 分类号: C12Q1/6851;C12Q1/6886
代理公司: 北京集佳知识产权代理有限公司 11227 代理人: 郑斌;尹玉峰
地址: 德国*** 国省代码: 暂无信息
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摘要:
搜索关键词: 核酸 分子 检测
【说明书】:

发明涉及用于以较低检测限检测核酸分子的方法。

技术领域

本发明涉及用于以较低检测限检测核酸分子的方法。

背景技术

取自测试对象的生物样品中特定核酸分子的表达水平可以是特定疾病或病症的存在、不存在和/或程度的指标。

例如,微RNA(miRNA)表达谱的产生已经表明,在不同的疾病中,健康测试者与患者之间的特定miRNA的表达存在明显的变化。miRNA是短的、高度保守的非编码RNA,其在基因调控的复杂网络中起重要作用。它们通过调控mRNA稳定性和翻译特定结合信使RNA(mRNA)并控制基因表达。通常地,miRNA由21至23个核苷酸组成。

许多诊断相关的核酸分子(例如特定miRNA),难以准确地定量,由于它们的小尺寸和它们通常在生物样品中的低浓度两者。

为了检测特定miRNA的表达水平,miRNA通常从生物样品分离并逆转录成合成DNA(cDNA)。然后使用定量实时PCR(qRT-PCR)确定miRNA表达水平。在一些情况下,在实际测量之前进行预扩增步骤。如果(i)不存在足够的miRNA原料用于几种分子生物测定方法(实时PCR,微阵列等)中,和/或(ii)样品中miRNA的浓度太低(即,在没有预扩增的情况下,在实时PCR期间不会产生信号),则进行这个附加步骤。

然而,如下面的比较例1中所示,如果靶核酸分子以较低检测限下的量(例如每个样品小于1000个分子)存在,则这种“经典”方法无法准确和可靠地确定表达水平。

因此,本发明的一个目的是提供便于准确和可靠地确定生物样品中在较低检测限下的特定核酸分子(例如miRNA)的表达水平的方法。

发明内容

在一方面中,本发明涉及确定生物样品中特定核酸分子的表达水平的方法,所述方法包括以下步骤:

(i)提供包含从所述生物样品分离/获得的DNA或cDNA的批次(batch)A;

(ii)提供步骤(i)中提供的批次A的三个或更多个等分试样,并用所述三个或更多个等分试样中的每一个进行独立的聚合酶链式反应(PCR)以扩增所述特定核酸分子,从而提供包含经扩增的特定核酸分子的三个或更多个批次B;以及

(iii)将等量的所述三个或更多个批次B混合,从而提供批次C,并通过基于PCR的方法确定批次C中所述特定核酸分子的水平,

其中在步骤(iii)中确定的水平对应于所述生物样品中所述特定核酸分子的表达水平。

在另一方面中,本发明涉及确定生物样品中特定核酸分子的表达水平的方法,所述方法包括以下步骤:

(i)提供包含从所述生物样品分离/获得的DNA或cDNA的批次A;

(ii)提供步骤(i)中提供的批次A的三个或更多个等分试样,并用所述三个或更多个等分试样中的每一个进行独立的聚合酶链式反应(PCR)以扩增所述特定核酸分子,从而提供包含经扩增的特定核酸分子的三个或更多个批次B;以及

(iii)通过基于PCR的方法确定所述三个或更多个批次B的每一个中所述特定核酸分子的水平,

其中在步骤(iii)中确定的水平的平均值对应于所述生物样品中所述特定核酸分子的表达水平。

在一个实施方案中,生物样品中特定核酸分子的浓度为≤1×10-11M、或≤1×10-12M、或≤1×10-13M、或≤1×10-14M、或≤1×10-15M、或≤1×10-16M。

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