[发明专利]使用力诱导的链侵入原位形成发夹

说明书

本发明涉及一种用于核酸测序反应的基底的制备方法。更具体地，本发明提供了一种使用力诱导的链侵入制备发夹的新方法。通过该方法制备的发夹和使用这些发夹的核酸分析方法也是本发明的一部分。

技术领域

本发明涉及一种用于核酸测序反应的基底的制备方法。更具体地，本发明提供了一种在单分子分析过程中使用的发夹的新制备方法。

背景技术

在很多情况下，可用于进行遗传或表观遗传分析的核酸(通常为DNA或RNA)的量有限的。样品类型包括肿瘤活检、人类学标本和法医标本。通常进行扩增以增加起始材料的量。然而，一些主要的缺点与扩增有关。特别地，表观遗传修饰在整个扩增过程中不是保守的。此外，依据同时分析的不同靶标的数量和序列，扩增显示可变的效率。

本发明人之前已经设计出能够确定核酸序列的单分子分析方法(WO2011/147931；WO 2011/147929)，以及一些相关的应用，包括DNA检测和定量(WO2013/093005)，以及蛋白结合核酸的检测(WO 2014/114687)。根据该方法，单核酸发夹通过拉动其端部而变性，例如采用磁镊。将拉力降低到阈值以下可以使发夹复性。然而，如果所述变性的发夹已经与单链寡核苷酸杂交，则至少瞬时地，复性将被阻断。然后可以通过确定阻断的持续时间和/或位置来解释双链分子的序列。

该方法需要产生发夹，其在一末端附着至比如珠的可移动的表面，另一末端附着至另一表面。目前，使用经典的DNA文库构建技术生产DNA发夹。通常，通过取感兴趣的双链核酸分子，并将合成的寡核苷酸附着至每一末端，以产生所需的结构，而获得这样的DNA发夹结构。这通常使用DNA连接酶进行。除了为样品制备增加成本和时间外，本发明人设计的测序方法目的的这种方法的主要缺点是其导致发夹文库的生产，然后必须将其附着至顺磁珠(在反应期间，或者在随后的步骤中)。此外，为了使用磁阱仪器询问(interrogate)分子，珠必须最终通过发夹分子固定到表面(例如流动池的底部)。

在这种方案中，调整发夹与珠的摩尔比变得至关重要。如果使用太多的发夹，则珠密集地被发夹覆盖，并且这能够导致通过多种发夹将珠附着至表面。这是非常不期望的情况，因为单分子分析方法只能在每个珠通过单发夹附着至表面上时进行，因为多于一个附着点阻止随后的变性步骤期间所需的自由的移动。即使对于确实通过一个发夹附着至表面的珠，与珠上其它部分结合的任何样品DNA也将失去分析，因此浪费有价值的样品材料。另一方面，如果使用太少的发夹，则大多数珠根本不会结合到表面，因为它们在流动池中流动时间的期间的结合概率是低的。

实证结果表明，以上讨论方案中发夹与珠的最佳比例在约100：1至1000：1。虽然在大量起始核酸可用的情况下这不是问题，但是在起始材料有限的这种情况下，能够分析样品中高百分比的DNA分子并且无定量或DNA修饰信息的丢失是至关重要的。

因此，仍然需要一种用于制备适于单分子核酸分析的发夹的方法，同时保持定量精确度。

发明内容

发明人现在已经发现了一种用于构建可用作单分子分析模板的发夹结构的新方法。因此，适合于后续分析的核酸发夹可以直接组装而不使用DNA酶(例如连接酶)，并且以这种方式使得可用于分析的DNA分子的数量最大化。

根据本发明的方法，发夹的组装被分成若干不连续的步骤。使用合成的DNA组分进行初始发夹前体生产步骤，并且至关重要地，不需要感兴趣的DNA样品。因此，它可以作为高度控制的过程批量进行，并且在进行分析本身很久之前进行。只有最终的发夹结构需要添加感兴趣的核酸。

本发明首先提供一种已经结合至两种不同表面的接收核酸分子，其可以提前制造和质量检查。这在成本和时间方面是特别有利的。因此，可以鉴定和丢弃低质量的接收分子，而不会浪费任何感兴趣的核酸的珍贵的分子，而现有技术的方法当然不是如此。在本发明的方法中投入核酸的使用是最佳的，导致最小的样品损失和采用低浓度样品工作的能力。