[发明专利]鹅膏毒素-抗体轭合物

说明书

本发明涉及轭合物，其包含鹅膏毒素和抗体，特别是与包含特定半胱氨酸残基的抗体连接的鹅膏毒素。

技术领域

本发明涉及轭合物，其包含鹅膏毒素(amatoxin)和抗体，特别是与包含特定半胱氨酸残基的抗体连接的鹅膏毒素。

背景技术

鹅膏毒素是由8个氨基酸组成的环肽，发现于鬼笔鹅膏(Amanita phalloides)蕈类中(见图1)。鹅膏毒素特异性抑制哺乳动物细胞的DNA-依赖性RNA聚合酶II，并且由此还抑制受影响细胞的转录和蛋白生物合成。细胞内转录的抑制导致生长和增殖的停止。尽管不是共价连接，但是鹅膏菌素(amanitin)与RNA聚合酶II之间的络合是非常紧密的(K_D＝3nM)。将鹅膏菌素从酶上解离是一个非常缓慢的过程，因而使得受影响的细胞不可能恢复。当转录抑制持续太久时，细胞将经历程序性细胞死亡(细胞凋亡)。

已经在1981年通过使用经由重氮化与色氨酸(氨基酸4，见图1)吲哚环连接的连接体将抗Thy1.2抗体与α-鹅膏菌素(α-amanitin)偶联而开发了鹅膏毒素作为细胞毒性部分用于肿瘤治疗的用途(DavisPreston,Science 1981,213,1385-1388)。DavisPreston确定了连接的位置为7’位。MorrisVenton同样证明了7’位取代产生的衍生物，其保持了细胞毒活性(MorrisVenton,Int.J.Peptide Protein Res.1983,21 419-430)。

专利申请EP 1 859 811 A1(2007年11月28日公开)描述了轭合物，其中β-鹅膏菌素(β-amanitin)的鹅膏毒素氨基酸1的γC-原子直接(即无连接体结构)与白蛋白或者单克隆抗体HEA125、OKT3或PA-1偶联。此外，这些轭合物显示了对乳腺癌细胞(MCF-7)、伯基特淋巴瘤细胞(Raji)和T淋巴细胞(Jurkat)的增殖的抑制作用。虽然该申请中建议使用连接体，包括包含例如酰胺、酯、醚、硫醚、二硫化物、脲、硫脲、烃部分等元件的连接体，但是实际上并没有给出这样的结构，且没有提供更多的详细内容，例如在鹅膏毒素上的连接位点。

专利申请WO 2010/115629和WO 2010/115630(都于2010年8月14日公开)描述了轭合物，其中抗体，例如抗EpCAM抗体，如人源化抗体huHEA125，通过(i)鹅膏毒素氨基酸1的γC-原子(ii)鹅膏毒素氨基酸4的6’C-原子或(iii)鹅膏毒素氨基酸3的δC-原子与鹅膏毒素偶联，每种情况下直接偶联或通过抗体与鹅膏毒素之间的连接体偶联。所建议的连接体包含例如酰胺、酯、醚、硫醚、二硫化物、脲、硫脲、烃部分等元件。另外，这些轭合物显示了对乳腺癌细胞(MCF-7细胞系)、胰腺癌细胞(Capan-1细胞系)、结肠癌细胞(Colo205细胞系)和胆管癌细胞(OZ细胞系)的增殖的抑制作用。

上述方法的缺点在于，与蛋白质靶向结合结构域(如抗体)中的赖氨酸残基的偶联是非特异性的，导致具有不同药物-抗体比例(DAR)的混合组分的轭合物，无法对DAR进行可靠地控制。例如，在典型的人IgG1抗体中存在约70至100个赖氨酸氨基酸残基。通常，通过使适当活化的鹅膏毒素构建体与赖氨酸残基反应获得约4的DAR。另外，观察到了非常不均匀的偶联位置的混合物，一些导致轭合物更高效力，一些具有更低效力。在此，无法获得特定的控制程度。

类似地，由于人IgG1中存在32个半胱氨酸，且其中8个可在还原四个链间二硫键后用于偶联，因此使用由还原抗体分子中的二硫键然后与携带硫醇反应性基团的毒素偶联而得到的半胱氨酸，会导致形成不均匀的混合物。

可以观察到，毒素-抗体轭合物的细胞毒活性随所得到的DAR的增加而升高，并因此其治疗效果也随所得到的DAR的增加而升高。然而，同时，耐受性随着DAR的增加而降低。因此，为了优化毒素-抗体轭合物的性能，非常希望控制与抗体偶联的毒素数量(即DAR)以及毒素轭合物的具体定位。只有在这种情况下，才可以实现可用治疗窗的精确调整和结果的再现性。