[发明专利]聚合酶变体及其用途

说明书

相关申请

本申请是于2016年2月1日提交的标题为“Polymerase Variants”的美国申请15/012,317的部分继续申请，其要求享有于2015年5月14日提交的标题为“Polymerase Variants”的美国临时申请62/161,571、于2015年8月9日提交的标题为“Polymerase Variants”的美国临时申请62/202,895和于2016年5月10日提交的标题为“Polymerase Variants and Uses Thereof”的美国申请15/151,364的优先权。

序列表

本申请含有已经以ASCII格式电子提交的序列表，且所述序列表以其整体通过引用并入本文。所述ASCII拷贝创建于2016年5月10日，命名为20-04338.521WO2_SL.txt，且大小为17,989字节。

技术领域

本文尤其提供了含有基于定向进化实验中鉴定的突变的氨基酸改变的经修饰的DNA聚合酶，所述定向进化实验被设计用于选择更好地适合于重组DNA技术中应用的酶。

背景

DNA聚合酶是一种酶家族，其使用单链DNA作为模板以合成互补 DNA链。具体而言，DNA聚合酶可以将游离核苷酸加入新形成链的3’端，导致新链在5’至3’方向的延伸。大多数DNA聚合酶是具有聚合和核酸外切活性的多功能蛋白。例如，许多DNA聚合酶具有3′→5′核酸外切酶活性。这些聚合酶可以识别不正确掺入的核苷酸，并且酶的3′→5′核酸外切酶活性允许切除不正确的核苷酸(该活性被称为校读)。核苷酸切除后，聚合酶可以重新插入正确的核苷酸，并且复制可以继续。许多DNA聚合酶也具有5′→3′核酸外切酶活性。

已经发现聚合酶用于重组DNA应用，包括纳米孔测序。然而，DNA链以1μs至5μs/碱基的速度快速移动通过纳米孔。这使得记录困难并且容易出现背景噪声，而不能获得单核苷酸分辨率。因此，在DNA链或其片段的测序中可以使用在核苷酸上的可检测标签的应用。因此，不仅需要控制测序DNA的速率，而且还提供具有改善性能(相对于野生型酶)(诸如掺入经修饰的核苷酸，例如具有或不具有标签的多磷酸核苷酸)的聚合酶。

发明概述

本发明提供了基于定向进化实验的经修饰的DNA聚合酶(例如，突变体)，所述定向进化实验被设计用于选择在工业或研究应用中使用的条件下赋予有利表型的突变(例如催化经修饰的多磷酸核苷酸(例如标记的核苷酸，在高盐浓度下)的掺入)。

在一个方面，存在变体聚合酶，其在对应于以下的位置处包含至少一个改变：SEQ ID NO:2 (Pol6 (具有His标签))的H223、N224、Y225、H227、I295、Y342、T343、I357、S360、L361、I363、S365、S366、Y367、P368、D417、E475、Y476、F478、K518、H527、T529、M531、N535、G539、P542、N545、Q546、A547、L549、I550、N552、G553、F558、A596、G603、A610、V615、Y622、C623、D624、I628、Y629、R632、N635、M641、A643、I644、T647、I648、T651、I652、K655、W656、D657、V658、H660、F662和L690。

在一个实施方案中，提供了具有DNA聚合酶活性的经修饰的DNA聚合酶，其包含与SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列。